ICS 65.020 CCS B 10 DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1843—2022 牛结核病多方法联合诊断规程 Code of practice of multiple diagnostic tests for bovine tuberculosis 2022 - 03 - 23 发布 湖北省市场监督管理局 2022 - 05 - 23 实施 发 布 DB42/T 1843—2022 目 次 前言 ............................................................................... III 引言 ................................................................................. V 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 单皮内变态反应和 ELISA 抗体检测法联合 ............................................... 2 6 ELISA 抗体检测法和 IFN-γ 体外释放法联合 ............................................. 2 7 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合 ............................................... 3 8 单皮内变态反应和 IFN-γ 体外释放法联合 .............................................. 4 9 临床剖检和/或细菌培养和 PCR 检测分型法联合 .......................................... 4 10 生物安全操作要求 .................................................................. 6 I DB42/T 1843—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：华中农业大学、湖北劲牛牧业有限公司、高安市裕丰农牧有限公司。 本文件主要起草人：陈颖钰、郭爱珍、章恺伦、闫钰、胡长敏、李翔、曾稳兵、杨建军、陈焕春。 本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱： hbsnab@126.com；对本文件的有关修改意见建议请联系华中农业大学，电话：027-87286861，邮箱： chenyingyu@mail.hzau.edu.cn。 III DB42/T 1843—2022 引 言 牛结核病（Bovine Tuberculosis）是由结核分枝杆菌复合群成员牛分枝杆菌、结核分枝杆菌及山 羊分枝杆菌等感染导致的一种慢性消耗性人兽共患病，临床呈慢性经过，导致肺结核、肠结核、乳腺结 核等多器官结核。在我国一、二、三类动物疫病的病种名录中，牛结核病规定为二类疫病。《国家中长 期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中，奶牛结核病被列为优先防治的动物病种。由于国家对牛结 核病采取检疫扑杀策略进行控制和净化，准确诊断牛结核病是牛结核病控制、净化的重要前提。 然而牛结核病诊断缺乏快速、灵敏、低成本、适合于现场诊断的金标准。现有诊断方法包括：皮内 变态反应（单皮内变态反应及比较皮内变态反应）、IFN-γ体外释放法、ELISA抗体检测法、临床剖检 诊断、细菌学诊断及PCR检测等。皮内变态反应是牛结核病检测中最经典的方法，敏感性高，成本相对 低，但特异性较差，操作费时、费力；IFN-γ体外释放法是目前灵敏性和特异性均高的检测方法，48 h 之内就可以出结果，但价格最为昂贵，且具有较高的实验室技术要求。该两种方法主要针对牛结核病的 细胞免疫反应阶段，均适合于牛结核病的早期检测。ELISA抗体检测方法操作成熟，简便、快捷，适合 于高通量检测；由于主要针对牛结核病的体液免疫反应阶段，适合于牛结核病的晚期检测。临床剖检诊 断是基于观察结核结节等病理变化的死后诊断方法，适合于牛结核病的追踪溯源，但不适合于临床活体 检测。结核分枝杆菌培养和种型鉴定准确性高，但敏感性差，耗时长，且需在生物安全三级实验室进行 操作，同样不适合于临床检测。PCR检测能够对带菌组织样本或培养物进行种型鉴定，但由于牛结核病 具有慢性经过和持续感染等特征，活体采样往往难以达到检测所需的菌量，因此，也不适合于活体检测。 为了在现有技术条件下提升牛结核病检测的敏感性和特异性，最大限度地减少假阳性牛错杀和假阴 性牛漏检，本文件从各方法的检测原理、敏感性和特异性以及检测成本等多方面综合考虑，制定了一套 适用于牛结核病不同流行背景和检测条件的多方法联合诊断方案，对牛结核病多方法联用的条件和技术 进行了规定，以期为临床牛结核病的精准诊断提供依据。 V DB42/T 1843—2022 结核病多方法联合诊断规程 1 范围 本文件规定了牛结核病多方法联合诊断规程中的单皮内变态反应和ELISA抗体检测法联合、ELISA 抗体检测法和IFN-γ体外释放法联合、单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合、单皮内变态反应和 IFN-γ体外释放法联合、临床剖检和/或细菌培养和PCR检测分型法联合以及生物安全要求等。 本文件适用于牛结核病检疫、监测和净化过程中的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 18645-2020 动物结核病诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27639-2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 GB/T 32945-2016 牛结核病诊断 体外检测γ干扰素法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛结核病 bovine tuberculosis 牛结核病是由牛分枝杆菌、结核分枝杆菌及山羊分枝杆菌等结核分枝杆菌复合群成员感染所引起的 一种慢性细菌性疾病，包括持续感染和活动性结核病两种类型。 3.2 个体流行率 individual prevalence 一段时间内某群体中患病的动物总数与同时间该群体暴露动物数之比。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DMSO：二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide） ELISA：酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay） IFN-γ：伽马干扰素（Interferon-γ） 1 DB42/T 1843—2022 PCR：多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） 5 单皮内变态反应和 ELISA 抗体检测法联合 5.1 适用对象 同时具备临床检测和实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率小于3%的场群。 5.2 操作步骤 按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤对待检牛进行单皮内变态反应（以下简称单皮试法）检 测，再对单皮试法检测为阴性的个体，使用商品化ELISA抗体检测试剂盒进行进一步检测。 5.3 结果判定 单皮试法检测为阳性，或ELISA抗体检测法检测为阳性的牛均判为结核阳性。 5.4 单皮试法和 ELISA 抗体检测法联合诊断流程图 单皮试法和ELISA抗体检测法联合诊断流程如图1所示。 图1 单皮内变态反应和抗体检测法联合诊断流程图 6 ELISA 抗体检测法和 IFN-γ体外释放法联合 6.1 适用对象 具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率小于3%的场群。 6.2 操作步骤 使用ELISA抗体检测试剂盒对待检牛进行牛结核病抗体检测，再对ELISA抗体检测为阴性的个体，按 照GB/T 32945-2016中4.3所规定步骤进行牛结核IFN-γ体外释放法检测。 6.3 结果判定 ELISA抗体检测法检测为阳性，或IFN-γ体外释放法检测为阳性的牛均判为结核阳性。 6.4 ELISA 抗体检测法和 IFN-γ体外释放法联合诊断流程图 2 DB42/T 1843—2022 ELISA抗体检测法和IFN-γ体外释放法联合诊断流程如图2所示。 图2 ELISA 抗体检测法和 IFN-γ体外释放法联合诊断流程图 7 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合 7.1 适用对象 不具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率大于等于3%的场群。 7.2 操作步骤 按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤对待检牛进行单皮试法检测，再对单皮试法检测为阳性 的个体，按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤进行比较皮内变态反应（以下简称比较皮试法）检 测。 7.3 结果判定 单皮试法和比较皮试法检测均为阳性的牛判为结核阳性。 7.4 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程图 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程如图3所示。 图3 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程图 3 DB42/T 1843—2022 8 单皮内变态反应和 IFN-γ体外释放法联合 8.1 适用对象 牛场具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率大于等于3%的场群。 8.2 操作步骤 按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤对待检牛进行单皮试法检测，再对单皮试法检测为阳性 的个体，按照GB/T 32945-2016中4