ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1864.4—2022 家禽疫病诊断技术规程 第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series—— Part 4: Test method for ELISA detection of avian leukosis antigen 2022-05-26 发布 湖北省市场监督管理局 2022-07-26 实施 发 布 DB42/T 1864.4—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 引言 ................................................................................ III 1 范围 ............................................................................... 4 2 规范性引用文件 ..................................................................... 4 3 术语和定义 ......................................................................... 4 4 原理 ............................................................................... 4 5 试验条件 ........................................................................... 5 6 试剂或材料 ......................................................................... 5 7 仪器设备 ........................................................................... 5 8 样品 ............................................................................... 6 9 试验步骤 ........................................................................... 7 10 结果判定 .......................................................................... 7 11 生物安全措施 ...................................................................... 8 I DB42/T 1864.4—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件DB42/T 1864《家禽疫病诊断技术规程》为系列标准。 本部分为DB42/T 1864的第4部分。DB42/T 1864发布了以下部分： ——第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。 ——第 2 部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测 ——第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。 ——第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：汪宏才、罗青平、邵华斌、彭伏虎、温国元、王红琳、张蓉蓉、卢琴、罗玲、 张腾飞、张文婷、商雨 本 文 件 实 施 应 用 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： hbsnab@126.com；对本规程的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电 话：027-87156122，邮箱：397321935@qq.com。 II DB42/T 1864.4—2022 引 言 近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作，在国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治 规划（2012～2020年）》中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及 蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健 康与食品安全，依据《湖北省重点农业产业链实施方案》，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽 致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提 升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病防控的需要，研制了《家 禽疫病诊断技术规程》系列标准，拟由4个部分构成。 ——第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽 J 亚群白血病病毒、马立克氏病病 毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。 ——第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致 病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。 ——第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。目的在于检测 鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡 肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。 ——第四部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、 肛拭子中禽白血病抗原 ELISA 检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。 III DB42/T 1864.4—2022 家禽疫病诊断技术规程 第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法 1 范围 本文件规定了种鸡场禽白血病酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA） 检测方法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤及结果判定。 本文件适用于种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原ELISA检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 26436 禽白血病诊断技术 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 NY/T 680 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽白血病病毒 avian leukosis virus, ALV 禽白血病病毒属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、α反转录病毒属的一类病毒。ALV可分为A～ K 11个亚群，其中与鸡相关且需净化的亚群主要有A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群和K亚群6个外 源性病毒。 3.2 酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体反应的高度特异性与酶标记技 术相结合，进行免疫反应的定性和定量检测方法。 4 原理 本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将抗禽白血病病毒 p27蛋白单克隆抗体吸附到固相载体的表面后，形成固相抗体。加入待测样本，孵育使待测样本中p27 抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体-抗原复合物。加入兔抗p27蛋白多克隆抗体后，再加入辣根过 4 DB42/T 1864.4—2022 氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体形成复合物。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的 量与待测物中禽白血病病毒p27蛋白的量直接相关，因此可以根据颜色的深浅来进行定性或定量分析。 5 试验条件 实验操作应在室温（18℃～25℃）下进行。样品前处理应在二级生物安全柜中进行。 6 试剂或材料 6.1 试剂配制 本方法试验用水应按照GB/T 6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T 27403规定。 6.2 试剂或材料 6.2.1 捕获抗体：抗禽白血病病毒 p27 蛋白单克隆抗体。将 ALV 病毒 p27 蛋白基因克隆至原核表达载 体 pET28a，构建 pET28a-P27 重组质粒，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导表达获得 p27 蛋白。将纯化的 p27 蛋白作为免疫原，免疫 Balb/c 小鼠后，取脾细胞与 SP2/0 细胞融合，经过筛选和 纯化后，注射小鼠腹腔，生产单克隆抗体。 6.2.2 检测抗体：兔抗 p27 蛋白多克隆抗体。以纯化的 ALV 重组 p27 蛋白为免疫原，经背部皮下免疫 体重约 2.5 Kg 的日本大耳白兔 3 次。首次将 p27 蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后，按 1.0 mg/只的剂 量免疫。效价较高时心脏釆血，分离血清。经效价测定后，置于-20℃冰箱中，保存备用。 6.2.3 阳性对照：禽白血病病毒感染 DF1 细胞培养液。 6.2.4 阴性对照：空白 DF1 细胞培养液。 6.2.5 磷酸盐缓冲液（PBS）：氯化钠（NaCl）8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.9 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，加水至 1 000 mL，置 2℃～8℃保存备用。 6.2.6 包被液：碳酸钠（Na2CO3）1.59 g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g，加水至 1000mL，置 2℃～8℃ 保存备用。 6.2.7 封闭液：牛血清白蛋白（BSA）5 g，氯化钠（NaCl）8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，十二水磷酸氢 二钠（Na2HPO4 ·