ICS 11.020 CCS C 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3375—2022 高血压用药指导基因检测 实时荧光定量 PCR 法 Real-time fluorescent quantitative PCR for the detection of hypertension medication guidelines genetic testing technical guidelines 2022 - 06 - 23 发布 吉林省市场监督管理厅 2022 - 07 - 23 实施 发 布 DB22/T 3375—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省卫生健康委员会提出并归口。 本文件起草单位：吉林大学。 本文件主要起草人：姜艳芳、胡馨元、郝思嘉、胡欣彤、何佳雪、刘勇、刘思文、张鹏、邹红雁、 王多、肖云萍。 I DB22/T 3375—2022 高血压用药指导基因检测 实时荧光定量 PCR 法 1 范围 本文件规定了高血压用药基因检测原理、生物安全要求、材料与试剂、样本、检测、数据处理、质 量控制、结果判定与表述、检测报告、废弃物处理与防止污染的措施。 本文件适用于高血压用药基因检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 卫医发〔2006〕73号 医疗机构临床实验室管理办法 国务院令第588号 医疗废物管理条例 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid ，DNA 核酸的一种，是由特殊序列的脱氧核糖核苷酸单元（dNTP）构成的多聚核苷酸，起携带遗传信息的 功能。DNA为一种双链分子，通过核苷酸碱基对间的氢键维系。DNA包含的4种核苷酸包括：腺嘌呤（A）、 鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人类存在两种类型的DNA：来自染色体的基因组DNA（gDNA） 和线粒体DNA(mtDNA)。 3.2 药物基因组学 pharmaeogenomies，PGx 药理学或基因组学的一个分支，是在遗传学、基因组学、遗传药物学基础上发展起来的，是研究基 因组或基因变异对药物在人体内吸收、代谢、疗效及不良反应的影响，利用基因组学信息解答不同个体 对同一药物反应上存在差异的原因的一门学科。 3.3 聚合酶链式反应法 polymerase chain reaction，PCR 一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段.可看作生物体外的特殊DNA复制。 3.4 实时荧光定量 PCR 法 quantitative Real-time PCR ,qPCR 1 DB22/T 3375—2022 在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号累积实时检测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样 品中的目的序列进行定量分析的方法。 3.5 基因 gene 遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA。 3.6 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism，SNP 由单个核苷酸—A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体 基因组的多样性。 3.7 阈值 threshold 计算机根据基线的变化所任意选择的，是指3到15个循环的基线荧光信号均值标准差的10倍。 3.8 内标基因 endogenous reference gene 在反应体系中加入的一段在所有细胞类型都正常表达的基因，不受实验处理的影响，可以正常表达。 3.9 Ct 值 cycle threshold ，Ct 荧光定量PCR反应的荧光强度超过设定的阈值所需的循环数。Ct值位于PCR反应的指数期初期，与标 本中待测核酸分子的原始拷贝数呈反比，即样本中原始拷贝数越多，荧光强度升高的就越多，相应的Ct 值就越小。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA:四元羧酸乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)。 PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。 DNA:脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid)。 SNP:单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism） 5 原理 采用细胞裂解方法从外周血细胞中将基因组DNA提取出来后，针对人类CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、 AGTR1、ACE 、CYP3A5、NPPA基因各个SNP位点的不同多态性，基于荧光定量PCR平台，首先针对SNP位点 上下游设计特异性引物，分别针对野生型及突变型位点设计不同荧光基团标记的特异性探针，然后对引 物及探针进行科学的配比组合，配置SNP位点检测体系，通过荧光定量PCR仪对临床样本DNA进行PCR扩增， 同时收集扩增信号，如果信号为野生型探针信号，那么样本为纯合野生型；如果信号为突变型探针信号， 那么样本为纯合突变型；如果信号同时有野生型及突变型探针信号，那么样本为杂合突变型。 高血压相关基因参见附录A。 6 生物安全要求 采样及检测过程所涉及的实验操作应按 GB 19489 规定执行。 2 DB22/T 3375—2022 7 材料与试剂 7.1 仪器与耗材 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 7.1.5 7.1.6 7.1.7 7.1.8 7.1.9 7.1.10 7.1.11 7.2 II 级生物安全柜。 涡旋混合仪。 金属浴或水浴锅。 高压灭菌器。 微量移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。 微量带滤芯吸头：10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。 医用冰箱：2 ℃～8 ℃、-20 ℃、-80 ℃。 低温高速离心机，最高离心力达 15 000 g/min 以上。 低速离心机，最高离心力达 3 000 g/min 以上。 荧光定量 PCR 仪。 离心管：200 μL、1.5 mL、15 mL。 试剂 7.2.1 试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水，所用化学试剂均为 分析纯。 7.2.2 DNA 提取试剂：对样本进行 DNA 提取。 7.2.3 DNA 扩增试剂。 7.2.4 对照品：弱阳性对照是一段基因型为 AGTR1 1166 A、 AGTR1 1166 C、ACE I、ACE D、ADRB1 1165 G、ADRB1 1165C、CYP2D6 *10C、 CYP2D6 *10T、CYP2C9*3A、 CYP2C9*3C、CYP3A5*3A、CYP3A5*3G、 NPPA 2338T 和 NPPA 2338C 的质粒混合液。空白对照是 Tris-HCL 缓冲液。 7.2.5 质控品：阴性质控样本可以是无相关基因的同类样本和不含任何核酸的水样本。阳性样本可以 为已确认的 CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE 、CYP3A5、NPPA 基因分型样本或体外构建的已含 CYP2D6、 CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA 基因分型的质粒。 8 8.1 样本 采集 采血前核对病人姓名、性别、年龄、编号及检验项目等。使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集受 检者静脉全血样本2 mL，采集后将采血管颠倒混匀数次，保证抗凝效果，并在抗凝管外部标签纸上详细 登记好血样信息，包括住院号或门诊号、姓名、性别、采样日期和时间、样本类型等。样本接收记录表 参见附录B。 8.2 保存运输 8.2.1 抗凝全血在室温保存不超过 7 天，2 ℃～8 ℃不超过 1 个月，-20 ℃不超过 7 周，血液样品反 复冻融不超过 5 次。 8.2.2 在 2 ℃～8 ℃条件下运输。 8.3 接收拒收 8.3.1 样本接收 3 DB22/T 3375—2022 实验室应安排专人接收样本，接收人在接收样本时应进行仔细检查。首先确认送检样本的相关信息 是否完全，样本标识清楚。到达时需要确认样本使用符合要求的的容器进行采集，有无开盖，全血样本 量是否达到2 mL，样本接收时送样人和接收人在样本接收登记表见附录B，实行双签名制度。 8.3.2 拒收样本 主要包括以下情况对于不符合要求的样本应该拒收，并在样本接收登记表中予以登记。 a) 申请单信息填写不完整，不清楚，与样本标识不符； b) 样本采集容器不符合要求，送检过程中容器有破损或者开盖情况； c) 全血样本量少于 2 mL，血液样本出现凝血或溶血。 8.4 检测 8.4.1 样本 DNA 提取 参考血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，所提取DNA需测定浓度及纯度，要求DNA的A260/280 在1.8～2.0之间，-20 ℃以下保存，避免反复冻融。待测样本的基因组DNA推荐浓度为5 ng/μL～15 ng/ μL。 8.4.2 样本 DNA 扩增 8.4.2.1 试剂准备 8.4.2.1.1 8.4.2.1.2 管内。 8.4.2.1.3 8.4.2.2 从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解混匀。 核算当次实验所需要的反应数 n，按照试剂盒说明装量将每种反应液分别分装到 n 个反应 PCR 反应管转移至样本准备区。 加样 8.4.2.2.1 将待测样本的基因组 DNA、弱阳性对照、空白对照、质控品分别加入已装有 PCR 反应液的 反应管中，即每个待测样本分别用此 PCR 反应液进行检测。 8.4.2.2.2 盖好 PCR 反应管盖，记录样本加样情况。 8.4.2.2.3 将 PCR 反应管瞬时离心，转移到核酸扩增区进行上机检测。若 PCR 反应管内加入模板后遇 临时情况不能立即上机，建议将加好模板的 PCR 反应管放于 2 ℃～8 ℃条件暂时保存，并在 24 小时内 尽快上机检测。 8.4.2.3 PCR 扩增 8.4.2.3.1 开机，并进行仪器性能自检； 8.4.2.3.2 取样本准备区准备好的 PCR 反应管，放置在仪器样品槽相应位置。并记录放置顺序。设置 仪器扩增相关参数，并开始进行 PC