ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T29397—2012 香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定 Detection and identification of Fusarium oxysporum f. sp. Cubense (E. F. Smith) Snyder & Hansen Race 4 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T29397—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、广东省植物检疫站、华南农业大学 本标准主要起草人：王玉玺、王琳、吴立峰、姜子德、李敏慧、任小平、李小妮、吴仕豪。 GB/T293972012 香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定 1 范围 本标准规定了香蕉枯萎病菌4号小种[Fusariumo.rysporumf.sp.Cubense(E.F.Smith)Snyder& HansenRace4的现场检验和实验室检测鉴定以香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状、病原菌形态、致病 保存的方法。 本标准适用于香蕉（包括香蕉、大蕉、粉蕉等香蕉枯萎病菌4号小种易感品种）生长期间的香蕉枯菱 病菌4号小种的检测。 2原理 根据香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状，取病健部交界组织分离培养病原菌，根据病原菌形态、致 病性测定结果、疑似病菌在Komada改良培养基上的菌落性状进行判定。 3仪器、用具及药品 3.1仪器、用具 仪器：超净工作台、培养箱、光学显微镜、高压灭菌、照相机等 用具：铲、枝剪、砍刀、纸袋、油性笔、记录本、标签纸、小刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、挑针、酒 精灯等。 3.2药品 0.1%升汞、70%乙醇、无水乙醇、灭菌水、去离子水、40%甘油、磷酸氢二钾、氯化钾、7水硫酸镁、乙 二胺四乙酸铁钠、L-天门冬酰胺、半乳糖、琼脂粉、75%五氯硝苯可湿性粉剂、牛胆粉、硼砂、硫酸链霉素、 10%磷酸等。 4现场查验 4.1现场调查 4.1.1调查范围 香蕉种植地及香蕉试管苗二级苗生产和销售场地。 4.1.2调查方法 对香蕉枯萎病菌4号小种的寄主植物进行踏查，观察其生长状况；向香蕉种植者和管理人员询问， 确定疑似香蕉枯萎病菌4号小种为害的田块，对疑似田块进行现场检验 4.1.3症状识别 对地上部表现症状的植株，剖开其根部和假茎部维管束组织，观察是否发生颜色变化。 1 GB/T29397—2012 对地上部无明显症状的植株，随机抽取部分植株，观察其根部及假茎部位维管束组织是否发生颜色 变化。 症状表现参见附录A。 4.2样本的采集 采样前需对取样现场及病害症状拍照。 疑似病株的取样应选取症状典型、中等发病程度的植株，取样部位包括蕉头病健部交界组织 勿采用塑料薄膜包裹。样品应附上采集时间、地点、品种的记录和田间照片。采样后填写附录B。 5实验室检测鉴定 5.1病原菌的分离与培养 取病健部交界组织，切成小块（2mm×3mm），将小块组织先放于70%乙醇溶液中浸5s、再转人 0.1%升求溶液中浸泡1min～2min进行消毒处理，然后用灭菌水漂洗3次；将消毒处理和漂洗后的小 块组织置于PDA或PSA平板上恒温（25℃）培养，菌落白色絮状，基质淡紫或淡紫红色；培养5d～7d 结果符合附录A形态描述的，可继续按5.2的方法进行病原菌致病性测定。 5.2病原菌致病性测定 采用伤根浸菌接种法。将4～5叶期健康组培香蕉苗（巴西蕉或广东香蕉2号）自沙床中拔出，然后 用缓慢流出的自来水冲洗根部以去除附在其根上的沙子，再分别浸在配制好的各分离菌株抱子悬浮液 中（孢子浓度不低于1×105个/mL），以清水做对照，30min后移栽到盛有灭菌细沙的营养杯，置于温室 （25℃～32℃）,15d～20d后观察结果。罹病蕉苗如表现出附录A的症状。对病株进行组织分离，应 得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌。按照柯赫氏法则，可初步确定该病原菌为尖孢镰 刀菌古巴专化型4号小种。 5.3在Komada改良培养基上的菌落性状 5.3.1Komada改良培养基的配制 融化900mL基本培养基磷酸氢二钾，1g，氯化钾，0.5g；硫酸镁，0.5g；乙二胺四乙酸铁钠， 0.01g；L-天门冬酰胺，2g；半乳糖，10g；琼脂粉，16g；去离子水定容至900mL，高压灭菌」在无菌操 作下与100mL的盐溶液（5%五氯硝苯可湿性粉剂，0.9g；牛胆粉，0.45g；硼砂，0.5g；硫酸链霉素， 0.3g；用10%磷酸调pH值到3.8±0.2）混合，倒平板。 5.3.2Komada改良培养基上菌落特征 将经5.1测定的疑似病菌的单孢分离菌株接于Komada改良培养基平板上，25℃、40W普通日光 灯相距约30cm照射下培养10d后观察菌落性状，4号小种的菌落边缘为裂齿状，而1号小种及其他的 GB/T29397—2012 镰刀菌的菌落边缘则平滑，如图1。 6结果判定 根据病原菌的形态学、致病性测定，及疑似病菌在Komada改良培养基上菌落边缘出现齿状的特 征，按照柯赫氏法则可确定该病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种。 将实验室检测鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告》（见附录C）。 7菌种的保存 对判定为香蕉枯萎病菌4号小种的菌株进行标注，包括菌株来源、寄主的品系、采集时间、采集人和 鉴定人，并将菌株移至40%甘油管保存在一80℃冰箱；或将菌株培养在试管斜面上，长满后存于4℃ 冰箱。 3