ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T29396—2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Burkholderia glumae (Kurita&Tabei) Urakami et al. 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T29396—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：朱金国、莫瑾、朱水芳、赵文军、李芳荣、李一农、彭梓、钟文英。 I GB/T29396—2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderiaglumae）的检疫鉴 定以植物的形态学特征、生理生化特性、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据，明确了田间观察、分离 鉴定、样品保存的方法。 本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻细菌性谷枯病菌的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB15569一1995农业植物调运检疫规程 国际种子检验规程（ISTA） 3水稻细菌性谷枯病菌基本信息 中文名：水稻细菌性谷枯病菌（颖壳伯克氏菌；颖壳假单胞菌）。 学名:Burkholderia glumae(Kurita&Tabei)Urakami et al.。 异名:Pseudomonas glumae Kurita&Tabei。 病害英文名：Bacterial grainrot of rice。 属细菌界Bacteria、变形菌门Proteobacteria、乙型变形菌纲Betaproteobacteria、伯克氏菌目Burk holderiales、伯克氏菌科Burkhoideriaceae、伯克霍尔德氏菌属Burkholderia。 种子带菌是远距离传播的主要途径。 水稻细菌性谷枯病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据水稻植株的形态学特征进行田间观察，并采用分离培养、分子生物学和酶联免疫学筛选、生理 生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水稻细菌性谷枯病菌进行判定。 5 设备和材料 5.1冷冻高速离心机：转速≤15000r/min。 5.2PCR扩增仪。 5.3恒温培养箱：28℃±1℃。 5.4 显微镜：物镜头10×100×。 5天平：精度0.001g。 5.5 高压灭菌器。 5. 6 1 GB/T 29396—2012 5. 7 冰箱:0℃~4℃。 5.8 3均质器：转速4000r/min~8000r/min。 5.97 可调移液器：10μL~100μL，100μL1000μL。 5.10 器具：灭菌的镊子、剪刀、称量勺。 5.11 吸管：1mL、10mL。 5.12 灭菌平皿：直径90mm，玻璃或一次性塑料平皿。 5.13 三角瓶：100mL。 6 培养基和试剂 6. 1 S-PG培养基：见B.1。 6. 2 CCNT培养基：见B.2。 6. 3 SPA培养基：见B.3。 6. 4 0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液：见B.4。 6.5 革兰氏染色试剂：见B.5。 6.6 鞭毛染色试剂：见B.6。 6.7 明胶液化培养基：见B.7。 6.8 氧化酶试剂：见B.8。 6. 9 硝酸盐培养基：见B.9。 6.10 0过氧化氢酶试验试剂：见B.10。 6. 11 O-F葡萄糖利用培养基：见B.11。 6.12 葡萄糖酸盐培养基：见B.12。 6.13 精氨酸双水解酶试验用培养基（AD)：见B.13。 6.14淀粉水解培养基：见B.14。 6.15 糖利用培养基：见B.15。 7 田间检验 水稻细菌性谷枯病在水稻抽穗期至灌浆期的谷粒和植株上均可显现明显症状，通过田间观察可直 按以下操作进行抽样及实验室检验。 8抽样 水稻种子抽样可参照ISTA《国际种子检验规程》或者GB15569一1995中6.1方法进行 9 样品处理及分离培养 9.1水稻种子 大量种子样品先用蒸馏水冲洗后，称取10g或400粒种子放人90mL0.001%吐温-磷酸盐缓冲液 (pH7.0）中低温（5℃～15℃）浸泡4h～6h，用均质器打碎，制备样品提取液。如果是检测少量的种 子样品，取20粒种子加人10mL灭菌的0.001%吐温-磷酸盐缓冲液（pH7.0），用灭菌趟和研钵或是搅 拌器将种子充分碾磨，制成提取液。 2 GB/T29396—2012 将样品提取液置于22℃～25℃环境中4h~6h后，旋涡混匀悬浮液5min，悬浮液进行十倍梯度 稀释，稀释后的10X，和100×以及1000X三个稀释度的悬浮液取0.3mL，分别放人到3个S-PG和 CCNT的平血中（每个平血加0.1mL）。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在琼脂的表面。 9.2植物组织材料 9.2.1无症状组织 将10g左右样品直接放入90mL0.001%吐温-磷酸盐缓冲液中，均质1min制备成样品提取液。 按6.1方法进行稀释与涂布。 9.2.2未显症状的可疑组织 用灭菌的剪刀剪成2mmX7mm大小的小块，放入S-PG和CCNT平板中，滴人23滴（约 0.2mL）的生理盐水，放置5min～10min，让细菌从这些组织中渗出。 9.2.3有明显症状的叶片 从叶片损伤部位的前端切下2mm×7mm片段。将其放人70%的乙醇中15s~30s，消毒叶片组 织。在试管中用灭菌蒸馏水清洗叶片2～3次后放入S-PG和CCNT平板上。 10培养分离 接种后的平Ⅲ28℃士1℃培养3d后观察生长菌落形态，细菌性谷枯病菌在S-PG上呈现两种生 长形态，一种菌落为红褐色、圆形、光滑、隆起；另一种菌落为淡紫色、圆形、光滑、隆起。细菌性谷枯病菌 在CCNT上产生带有黄色扩散性色素的白色菌落 用接种环从平板中挑选5个以上生长典型或疑似菌落，接种到改良SPA蛋白陈培养基培养纯化， 以进行进一步生化鉴定试验，也可以采用BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定。对疑似菌落也可以采用 PCR方法进行初筛，或者采用水稻细菌性谷枯病菌的ELISA试剂盒进行初步筛选（具体检测方法参照 试剂盒说明手册），阳性结果再继续通过生化鉴定做进一步证实。 111 PCR筛选试验 从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板，进行PCR检测和电泳分析。用水稻细菌性谷枯病 标准菌株基因组DNA作为阳性对照，用不含有水稻细菌性谷枯菌株的植物组织材料或其他植物病原 菌基因组DNA为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。 将分离得到的可疑菌落接种SPA斜面.培养24h～48h后用无菌水洗下斜面上生长的菌苔，制成 菌悬液。使用制备好的菌悬液进行分子生物学鉴定，具体操作过程见附录C。若测试菌株的PCR产物 与阳性对照分子量一致，继续进行生化鉴定试验 12生理生化鉴定 12.1初步鉴定 挑取分离培养得到的符合特征的典型或可疑菌落分别进行氧化酶试验、过氧化氢酶试验、革兰氏染 色和鞭毛染色观察。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，革兰氏染色阴性，极生一至多条鞭毛，天小为 (0.5μm~0.7μm）×（1.5um~2.5μm），符合以上试验结果的菌落需进行以下生化鉴定实验（水稻细 3