ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T29393—2012 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 Detection and identification of Candidatus liberobacter asiaticum 2012-12-31发布 2013-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T29393—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、浙江省植物保护检疫局。 本标准主要起草人：吴立峰、严铁、林云彪、项宇、朱景全、朱莉。 1 GB/T293932012 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 1范围 本标准规定了柑桔黄龙病菌亚洲种Candidatusliberobacterasiaticumjagoueixetal.的检测与鉴 定方法。 本标准适用于植物检疫过程中对柑桔黄龙病菌亚洲种的检测与鉴定。 2病菌基本信息 中文名：柑桔黄龙病菌。 学名：Candidatus liberobacter asiaticum jagoueixet al. 病害英文名：CitrusHuanglongbingHLB。 属薄壁菌门Gracilicutes、韧皮部杆菌属Liberobacter。 3方法原理 根据柑桔黄龙病菌侵染柑桔植株发病典型症状进行田间鉴定；经嫁接或经柑桔木虱（Diaphorina citri）传病后，可根据木本指示植物发病症状鉴定；聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）检 测技术对柑桔黄龙病菌DNA进行体外扩增，可得到快速、有效的鉴定结果。 4仪器及用具 紫外线透射仪或凝胶成像系统，离心机，核酸电泳仪，pH计，移液器：10μL、20μL、100μL、 1000μL，PCR仪，水浴器、超纯水系统，电子天平。 5试剂与材料 TAE缓冲液，三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tris-HCI)，乙二胺四乙酸（EDTA），十二烷基硫酸钠 （SDS)，乙酸钠（NaAc），Taq酶，10XPCR缓冲液，25mmol/L镁离子（Mg²+），20mmol/L脱氧核苷三 磷酸（dNTP），5μLDNA荧光染料（GV），琼脂糖，溴酚蓝，高锰酸钾，三氯甲烷（氯仿），异戊醇，异丙醇， 乙醇。 6症状识别法 柑桔黄龙病主要鉴定依据是田间出现的“叶片斑驳型黄化”和“黄梢”。叶片斑驳型黄化即叶片转绿 后从主、侧脉附近和叶片基部开始黄化，黄化部分扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳，后来可以全叶黄 化。黄梢即在发病初期，绿色树冠上少部分新梢枝叶片黄化。有些柑桔结果树果实呈“红鼻子果”。在 柑桔黄龙病区符合上述典型症状的病苗、病树可直接鉴定为柑桔黄龙病。 对难以下结论的疑似病苗、病树，可根据具体情况选用以下一种或几种检测方法进行鉴定。 1 GB/T293932012 7指示植物鉴定法 7.1指示植物鉴定柑桔接穗带菌 以柑作指示植物。鉴定时用带有2～3个病芽的接穗，在健康槛柑实生苗上进行嫁接。重复3次 （嫁接工具每次使用前用高锰酸钾溶液消毒）。待嫁接愈合后，在其上方约1cm处剪除指示植物的主 干。每株疑似病株至少嫁接30株以上健康柑，以健康槛柑实生苗作对照，定期观察、记载指示植物新 抽枝叶的症状。一般柑桔黄龙病在指示植物上的潜育期为4～12个月。符合第6章所描述的发病症状 可鉴定为柑桔黄龙病。 7.2指示植物鉴定柑桔木虱带菌 从田间疑似病株上，采集柑桔木虱成虫50～100头，接到指示植物柑上饲养，定期观察、记载指示 植物症状。符合第6章描述的发病症状可鉴定接种柑桔木虱带有柑桔黄龙病菌。 8PCR检测法 8.1取样 取样包括疑似柑桔黄龙病叶片和柑桔木虱成虫二类。采集疑似柑桔黄龙病叶每样品20张叶片，直 接放于信封内（切忌塑料袋包装）。采集无病树和病树枝梢上柑桔木虱成虫每样品50～100头，置于 70%乙醇内浸泡2h～3h，然后取出放于塑料管内，供检测。样品可放入4℃冰箱保存。 将取样情况填人《植物有害生物调查抽样记录表》（见附录A）。 8.2方法 按附录B的规定进行 8.3结果及判定 每次扩增反应均设空白对照、来源可靠的阳性对照和不含病原DNA的阴性对照各1个，每个样品 均进行3次重复。如果阳性对照电泳后出现一条563bp特异性条带，阴性对照和空白对照电泳后没有 条带，试验结果成立，否则，结果不成立。 在试验结果成立的前提下，供试样品出现与阳性对照一样的条带，样品判定为阳性，即检出柑桔黄 龙病菌；供试样品未出现与阳性对照一样的条带，样品判定为阴性，即不带柑桔黄龙病菌。 9 记录与档案 将检测结果填入表格《植物有害生物样本鉴定报告》（见附录C），将检测的有关数据、图片等资料整 理保存。 10 标本保存 柑桔叶片放人4℃冰箱保存和柑桔木虱浸70%乙醇保存。 2 GB/T29393—2012 附录A （规范性附录） 植物有害生物调查抽样记录表 表A.1 植物有害生物调查抽样记录表 编号： 生产/经营者 地址及邮编 联系/负责人 联系电话 调查日期 抽样地点 样品 品种 调查代表 植物名称（中文名和学名） 植物生育期 植物来源 编号 名称 株数或面积 症状描述： 发生与防控情况及原因： 抽样方法、部位和抽样比例： 备注： 抽样单位（盖章）： 生产/经营者 填表人(签名）： 现场负责人 年月日 年月日 注：本单一式两联，第一联抽样单位存档，第二联交受检单位。 3