ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T294292012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas fragariae Kennedy & King 2012-12-31发布 2013-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T29429—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：刘天鸿、邵秀玲、赵文军、杨万风、厉艳、魏厚德、沙天慧、孟祥龙。 I GB/T29429—2012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了草莓角斑病菌XanthomonasfragariaeKennedy&King的检疫鉴定以形态学特征、 生物学特征和PCR特异性反应为依据，明确了样品采集、病原菌分离、致病性测定、PCR反应、样品保 存的方法。 本标准适用于草莓种苗中草莓角斑病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 3草莓角斑病菌基本信息 中文名：草莓角斑病菌。 学名:Xanthomonas fragariae Kennedy & King。 病害英文名：Angularleafspotofstrawberry。 属于原核生物界Procaryote，薄壁细菌门Gracilicutes，暗细菌纲Scotobacteria，假单胞杆菌科 Pseudomonadaceae，黄单胞杆菌属Xanthomonas。 该病菌可通过雨水和田间灌溉飞溅作局部传播、扩散，携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病 残体都可能随贸易作短距离和长距离的运输传播。 草莓角斑病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据草莓角斑病菌的危害症状采集样品，通过实验室分离、培养和致病性测定，以及分子生物学测 定等方法，依据病害的症状、病原菌的形态特征、生物学特性、生化特性、致病性测定，以及分子生物学特 征进行判定。 5仪器和用具 生物显微镜、生化培养箱、高压灭菌器、电子天平（感量0.01mg）、恒温振荡培养箱、超净工作台、 PCR仪、电泳装置、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、移液器、移液器枪头、研钵、量筒、烧杯、培养皿、PCR 管、离心管、接种针、玻璃棒、剪刀等 6主要试剂 蛋白陈、酵母膏、蔗糖、葡萄糖、琼脂粉、冰乙酸、乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、十六烷基三乙基溴化 1 GB/T29429—2012 脂糖（电泳用）、溴化乙锭（EB）、TaqDNA聚合酶、氯化钾（KCI）、磷酸氢二钾（KHPO）、氯化钠 （NaCI）、磷酸氢二钠（NazHPO,）、氯化镁（MgClz）、硫酸镁（MgSO·7H,O）、硝酸钠（NaNO：）、乙二胺 四乙酸钠（NaEDTA）、溴酚蓝、蛋白酶K、RNaseA、1OXPCR缓冲液、dNTP（dATP、dTTPdCTP、 dGTP)。 7检疫鉴定方法 7.1现场检疫 抽样数按SN/T1157中规定的方法进行。 在现场检疫时，应仔细检查草莓苗叶和茎有无病变症状，如在草莓叶面上发现水渍状红褐色不规则 形病斑、叶背溢出菌脓、植株生长点变黑等可疑症状时，应取样作实验室鉴定。 在产地检疫和隔离试种期间，还要注意检查有无淡红褐色干枯病叶或生长点死亡的植株，当发现可 疑症状应取样作实验室鉴定 7.2病原菌分离纯化 选取新发病的、带有水渍状病斑的病叶，用70%的乙醇进行表面消毒，切取病健交界处，无菌水冲 洗后碾碎，置于PBS缓冲溶液（参见附录B)中10min～15min。在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂 布于WILBRINK-N培养基（参见附录B)平板上，置于25℃培养5d～7d，然后再进行三次的纯化，最 后获得纯菌株。 7.3病原菌形态观察及生理生化测定 7.3.1形态观察 对分离纯化获得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜下观察形状，测量大小。 7.3.2菌落颜色 将菌株在WILBRINK-N或YPGA培养基（参见附录B)上划线培养，置于25℃培养5d～7d，观 察菌落的颜色和形状。 7.3.3生理生化测定 该菌生理生化测定见附录C。 7.4致病性测定 将WILBRINK-N或YPGA培养液（参见附录B)中培养3d～5d的菌株，用PBS缓冲溶液稀释到 10°CFU/mL，选取完全健康的草莓感病品种，用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面，每片叶扎 刺5～10次，最好不要扎穿叶子，设置五个重复，以PBS缓冲溶液为对照。接种后用塑料袋罩住植株， 使植株置于20℃～25℃、相对湿度≥80%的隔离温室里生长4周，每天观察并记录发病情况，出现症 状后，用7.2方法进行病原菌再分离、纯化， 7.5PCR法检测 该检测方法见附录D。 2 GB/T29429—2012 8鉴定特征 8.1症状特征 草莓角斑病菌初侵染时在叶片下表面出现1mm~4mm大小的水渍状红褐色不规则形病斑，病斑 扩大时受细小叶脉所限呈角形叶斑。病斑在可见光下呈透明状，在反射光下呈暗绿色。病斑逐渐扩大 后融合成一体，渐变淡红褐色而干枯。湿度大时叶背可见溢出菌脓，干燥条件下成一薄膜。病斑常在叶 尖或叶缘处，严重时使植株生长点变黑枯死，叶片发病后常干缩破碎形成孔洞。在适宜的条件下，花萼 也能受侵染。另外，该细菌还可导致维管束病变。 8.2病原特征 无荚膜杆菌，单个、成双或成短链，具单根极鞭，革兰氏染色阴性，大小约为0.4um×1.3um。病 菌生长较慢，在培养基上4d～5d才能形成菌落。营养琼脂上，菌落圆屋顶形，边缘整齐规则，有光泽， 黄色奶油状。好氧菌，氯化钠最大耐受力为0.5%~1.0%，生长最适温度25℃，超过33℃不能生长。 明胶液化、淀粉水解，不水解七叶苷，不从阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、纤维二糖溶液产酸，不能利用天冬 酰胺作唯一碳源和氮源。 8.3致病性特征 针刺接种后，在7d左右应出现水渍状红褐色病斑，这些病斑逐渐扩大坏死，经病原菌再分离获得 的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征。而所设的阴性对照并没有出现相应症状。 8.4分子生物学特征 测试菌株经PCR反应后，如果PCR产物与阳性对照条带一致（537bp），且阴性对照和空白对照均 没有相应条带，则能证明所测菌株为阳性。否则，则判断为阴性。 9结果评定 特征以及分子生物学特征与第8章描述相符，可以判定为草莓角斑病菌，否则结果判定为不是。 10样品保存 经检疫鉴定后，应妥善保存样品及菌株，以备复验、谈判和仲裁。保存期满，需经灭菌后方可处理。 11菌株保存 从检测样品中分离到并鉴定为草莓角斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到WILBRINK-N 或YPGA培养基斜面上，25℃恒温培养5d～7d。然后置于4℃冰箱中保存，定期（30d～60d)转接， 防止病菌死亡；必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，一80℃下长期保存。 3