ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28984—2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of banana bract mosaic virus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28984—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：闻伟刚、郭立新、杨翠云、陈先锋、雷荣、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽。 I GB/T28984—2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了香蕉苞片花叶病毒血清学和分子生物学特征的检测方法。 本标准适用于香蕉组培苗和植株等芭蕉属寄主植物材料中香蕉苞片花叶病毒的检测，也适用于蚜 虫等传播媒介中该病毒的检测。 香蕉苞片花叶病毒基本信息 中文名：香蕉苞片花叶病毒 学名:banana bract mosaic virus 缩写：BBrMV 属马铃薯Y病毒属（Potyuirus），香蕉苞片花叶病毒其他信息参见附录A。 3方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（Doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay，DAS-ELISA）、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）、实时荧光反转录聚合酶链式反应（real-time fluorescentRT-PCR）进行检测鉴定。 4仪器设备、用具和试剂 4.1仪器设备 常规PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（感量：0.001g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像 系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱（一80℃）、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪 4.2用具 可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 4.3试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。 5检测 5.1样品制备 取0.5g～10g畸形、变色等症状的叶片或其他植物组织，在研钵或小型食品加工机中充分研磨， 1 GB/T 28984—2012 取五分之一量的均匀后样品，转人离心管中，按1：10（质量：体积）加人样品提取缓冲液振荡混匀。媒 介昆虫按1：10（质量：体积）加入样品提取缓冲液研磨混匀。2000g离心10min，上清液即为 DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液。 注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃条件下。 5.2检测方法 5.2.1双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA） DAS-ELISA检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BBrMV的植物组织作阳性 对照，用样品提取缓冲液作空白对照。其中，阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致。 具体操作步骤见附录B。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作 5.2.2RT-PCR方法 RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BBrMV的植物组织作阳性对 照，用ddHO作空白对照。 具体操作步骤见附录C。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作。 5.2.3实时荧光RT-PCR方法 实时RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BBrMV的植物组织作阳性 对照，用ddH,O作空白对照。 具体操作步骤见附录D。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作。 6结果判定 样品经DAS-ELISA与RT-PCR检测，结果均呈阳性，可判定样品携带香蕉苞片花叶病毒。 样品经DAS-ELISA与实时荧光RT-PCR检测，结果均呈阳性，可判定样品携带香蕉苞片花叶 病毒。 7样品保存与记录 7.1样品保存 经检测确定携带香蕉苞片花叶病毒的样品保存在一80℃冰箱中，并做好登记和标记工作。样品保 存期限至少1年。 7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等。血清学测定 与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。 GB/T 28984—2012 附录A （资料性附录） 香蕉苞片花叶病毒相关资料 A.1名称 中文名：香蕉苞片花叶病毒 学名：banana bract mosaic virus 缩写：BBrMV 分类地位：马铃薯Y病毒属（Potyuirus） A,2 2寄主范围 目前只发现芭蕉属（Musaspp.）植物为其自然寄主。 A.3 3为害症状 病毒侵染香蕉植株后，病叶上沿着叶柄产生深绿色或褐色的梭条斑。而病株花序苞片上则出现黑 色斑点，这些症状常常十分明显，引起香蕉减产和品质下降。 A.4分布地区 该病毒主要分布于菲律宾和印度等国，在我国尚未见发生。 A.5传播方式 可由玉米缢管蚜（Rhopalosiphurnmaidis）和棉蚜（Aphisgossypi）以非持久方式传播，长距离扩 散则随感病植株的无性繁殖材料传播。 A,6 粒体形态 病毒粒子线形，长660nm～760nm，直径12nm。 A.7 7基因组 能被SDS降解，用硫酸溶液提取时，多数粒子的相对分子质量为38KDa，少数为55KDa；用蔗 糖溶液提取时，除上述分子外，还有少数相对分子质量为66KDa和21KDa的分子存在。 3