ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 287152012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 Determination of acidic and neutral protease activity in feed additives- Spetrophotometric method 2012-09-03发布 2013-02-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28715—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 学研究所、武汉新华扬生物有限公司。 本标准主要起草人：王小骊、柳爱春、邹晓庭、吴琪、赵芸、朱加虹、陈小丽、周樱、谢红云。 I GB/T28715—2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力的测定方法。 本标准适用于饲料添加剂酸性、中性蛋白酶产品中酶活力的测定，以及复合酶产品中中性蛋白酶活 力的测定。 本标准定量限为500U/g（U/mL）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酸性、中性蛋白酶活力单位acidicandneutralproteaseactiveunit 在一定温度（40℃士0.2℃）和相应的pH条件下（酸性蛋白酶pH3.0，中性蛋白酶pH7.2），在 1min内水解酪蛋白产生相当于1ug酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位， 以U表示。 4原理 蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸）， 在碱性条件下，可将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。 通过在680nm测定其吸光度，得到酶解产生的酚基氨基酸的量，进而计算蛋白酶活力。 5试剂和材料 除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682规定的二级水。 5.1碳酸钠溶液[c(Na2CO3)=0.4mol/L] 称取无水碳酸钠（NaCO：）42.4g，用水溶解并定容至1000mL。 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。 1 GB/T28715—2012 5.3盐酸溶液[c(HCI)=1mol/L] 取浓盐酸85mL，加水稀释并定容至1000mL，即为1mol/L盐酸溶液。 5.4盐酸溶液[c(HCI)=0.1mol/L] 取100ml1mol/L盐酸溶液（5.3），定容至1000mL，即为0.1mol/L盐酸溶液。 5.5氢氧化钠溶液[c（NaOH)=0.5mol/L] 取氢氧化钠20g，加水稀释并定容至1000mL，即为0.5mol/L氢氧化钠溶液。 5.6福林（Folin)试剂 25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱 中加入硫酸锂（Ll2SO）50g，水50mL和数滴浓漠水（99%），再微沸15min，以除去多余的漠（冷却后 仍有绿色需再加漠水，再煮沸除去过量的漠），冷却后加水定容至1000mL。混匀、过滤。试剂应呈金 黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份福林（Folin)试剂与2份水混匀，制成稀福林(Folin)试剂。 5.7乳酸缓冲液（pH3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取10.6g乳酸（85%~90%），加水稀释并定容至1000mL。 使用溶液：取4份甲液，加乙液（约1份）调整pH至3.0土0.05，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为 3 d。 5.8磷酸缓冲液（pH7.2,适用于中性蛋白酶） 分别称取磷酸氢二钠（NazHPO,)2.34g和磷酸二氢钠（NaH,PO4·2H,O)1.00g，用水溶解，用 0.1mol/L盐酸溶液（5.4)或0.5mol/L氢氧化钠溶液（5.5），单向调整pH至7.2士0.05，并定容至 1000mL，备用。 5.91%酪蛋白溶液 5.9.11%酸性酪蛋白溶液（pH3.0） 准确称取酪蛋白1.000g，先用约0.5mL浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液（5.7）约80mL，在沸 水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸溶液（5.4)或0.5mol/L 氢氧化钠溶液（5.5），单向调整pH至3.0士0.05，并转入100mL容量瓶中，用乳酸缓冲液（5.7）定容至 刻度。此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3d。 5.9.21%中性酪蛋白溶液（pH7.2)） 准确称取酪蛋白11.000g，先用约0.5mL氢氧化钠溶液（5.5）湿润后，再加人磷酸缓冲液（5.8）约 80mL，在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸溶液（5.4） 或0.5mol/L氢氧化钠溶液（5.5）单向调整pH至7.2土0.05，并转人100mL容量瓶中，用磷酸缓冲 液（5.8)定容至刻度。其余同5.9.1。 1）标准使用的酪蛋白由中国药品生物制品检定所提供。给出这一信息是为了给使用者提供一个相对标准，如果 其他产品能有相同的效果，则可以使用等效产品。 2 GB/T28715—2012 5.10L-酪氨酸标准物质 纯度≥95%。 5.11L-酪氨酸标准储备溶液 精确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸标准物质0.1000g，用20mL1mol/L盐酸溶液 （5.3）溶解后，再用蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液， 5.12L-酪氨酸标准溶液 临用前，准确吸取10.0mL1mg/mL酪氨酸标准储备溶液（5.11)，用0.1mol/L盐酸溶液（5.4） 定容至100mL，即得到100μg/mLL-酪氨酸标准溶液 6仪器与设备 除常用实验室仪器设备外，应有下述仪器设备： 6.1分光光度计：波长范围350nm~800nm。 6.2pH计：精度为0.01pH单位。 6.3分析天平：感量0.0001g和0.01g。 6.4恒温振荡水浴锅（或普通水浴锅）：精度为土0.2℃。 6.5秒表或定时钟。 7分析步骤 7.1标准曲线绘制 SAC 分别准确吸取100ug/mLL-酪氨酸标准溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、 5.00mL和6.00mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成每毫升分别含L-酪氨酸0.0uμg、 10.0μg、20.0μg、30.0μg、40.0μg、50.0μg和60.0μg的标准工作溶液。 分别吸取L-酪氨酸标准工作溶液1.0mL,加5.0mL碳酸钠溶液（5.1)和1.0mL稀福林（Folin） 试剂（5.6），于具塞试管中（每个浓度做2个平行），混勾。 将标准管同时置于40℃水浴，反应20min，取出，置于冷水中，迅速冷却至室温，用10mm比色皿， 以空白管调仪器零点，在分光光度计波长680nm处测吸光度。以L-酪氨酸含量为横坐标，以吸光度为 纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。回归系数（r²）在0.9978以上时，方可使用，否则应重做。 新配制的福林（Folin试剂应制作新的标准曲线。 7.2试样制备 7.2.1液体酶试样的制备 根据样品酶活力大小，吸取适量的液体酶液，酸性蛋白酶试样用乳酸缓冲液（5.7）[中性蛋白酶试样 则用磷酸缓冲液（5.8）稀释至酶活力约为5U/mL~20U/mL，待测 7.2.2固体酶试样的制备 将试样粉碎或充分碾碎，过孔径为0.25mm筛。根据样品酶活大小，称取0.2g～2g样品，精确至 3