ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28106—2011 郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Curtobacterium flaccumfaciens pv.oortii Collins & Jones 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28106—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局 本标准主要起草人：郭京泽、魏亚东、张裕君、刘跃庭、刘鹏、罗加凤、廖芳、王金成。 I GB/T28106—2011 郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了郁金香黄色疱斑病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于栽培及其他用途的郁金香球茎、郁金香植株上郁金香黄色疱斑病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3郁金香黄色疱斑病菌基本信息 中文名：郁金香黄色疱斑病菌。 学名：Curtobacterium flaccumfaciens pv.oorti。 异名：Corynebacterium flaccumfacienspv.oortii（Saaltink &Maas Geesteranus 1969)Dye & Kemp 1977,Corynebacteriumflaccumfaciens subsp.oortii(Saaltink &.Maas Geesteranus1969) Carlson &.Vidaver 1982,Corynebacterium oortii Saaltink &.Maas Geesteranus 1969。 病害英文名：tulipbacterialcanker，tulipyellowpustule。 属原核生物界Procaryotes，厚壁菌门Firmicutes，厚壁细菌纲Firmibacteria，短小杆菌属Curtobac terium。 该病菌随带病球茎调运远距离传播。带病球茎通过无性繁育将该病菌传播给子球。植株间通过带 菌病叶扩散传播。 郁金香黄色疱斑病菌其他信息参见附录A。 4方法原理 从病部样品中分离病菌并纯化，然后通过革兰氏染色、生理生化测定进行该病原细菌的鉴定。郁金 香黄色疱斑病菌的寄主范围、病害症状特征、生物学特性、生理生化特性（参见附录A和附录B)是该病 菌的检疫鉴定依据。 5仪器、设备 生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、八道移液器，BIOLOG细菌自动鉴定系统。 6试剂和培养基 无水乙醇、微量发酵管、革兰氏染色液。 1 GB/T28106—2011 523培养基：蛋白陈8g，酵母粉4g，硫酸镁（MgSO4·7H,O)0.3g，蔗糖（C12H22Ou）10g，磷酸氢 二钟（K，HPO）2g，琼脂18g水（H,O)1000mL。调整pH值至7.0~7.1，121℃湿热灭菌20min。 BUG培养基。 7对照菌株 已知标准菌株作阳性对照菌。选用本属不同种的菌株作为阴性对照菌。 8检测鉴定 8.1现场检测 按照SN/T2122的规定进行检疫并抽取样品。 若发现郁金香病株矮化，叶片出现银灰色斑，上下表皮开裂，茎杆内部变黄，球茎最外层鳞片上出现 白色斑，在球茎储藏后期病斑隆起变黄（参见A，3），应取样带回实验室做病菌分离鉴定。 8.2病原菌分离 取带病样品，用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭表面，晾干或用灭菌水冲洗3次。切取病健交界部位组 织置于灭菌的培养皿中加少量灭菌生理盐水，用玻棒碾碎，用接种环蘸取悬液在523培养基平板上进行 现的菌落情况。 8.3分离菌的纯化 SAC 观察523培养基平板上产生的菌落，有黄色、有光泽、圆形、边缘整齐、直径1mm～1.5mm的菌落 为可疑菌落。 挑取单个可疑菌落，在523培养基平板上划线，接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h～72h。 一般连续转接2次3次可得到纯化的分离菌 8.4革兰氏染色 按GB/T4789.28—2003中2.2规定的方法进行。 8.5生理生化测定 从郁金香上分离纯化的细菌经过革兰氏染色测定后，若分离菌为革兰氏染色阳性菌，则结合实验条 件任选下列一种方法对分离菌进行生理生化测定： 应用BIOLOG细菌自动鉴定系统对分离菌进行生理生化测定。按照BIOLOG细菌自动鉴定 系统规定的操作方法进行，鉴定结果为Curtobacteriumflaccumfaciens，则判定该分离菌的 BIOLOG鉴定结果为阳性； 应用微量发酵管对分离菌进行生理生化测定。测定结果与表B.1结果一致，则生理生化测定 结果为阳性。否则生理生化测定结果为阴性。 9结果评定 从郁金香上进行细菌分离纯化，若分离菌经过革兰氏染色为阴性菌，则判定检测结果为样品不带郁 金香黄色疱斑病菌。 2 GB/T 28106—2011 从郁金香上进行细菌分离纯化，分离菌经过革兰氏染色为阳性菌，BIOLOG鉴定结果为阳性，或用 微量发酵管进行生理生化测定其结果为阳性，则判定检验样品带有郁金香黄色疱斑病菌。否则判定检 验样品不带郁金香黄色疱斑病菌。 10 菌株和样品的保存 分离并鉴定为郁金香黄色疱斑病菌的菌株应转接到523培养基试管斜面上，经登记和经手人签字 后置于4℃低温冰箱中保存，定期转接，以防止病菌死亡；必要时冻干后长期保存。 3