ICS 65. 020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28066—2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. pisi (Sackett) Young et al. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28066—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 疫局。 本标准主要起草人：林石明、黄蓬英、易建平、陈青、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。 GB/T28066—2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学、血清学及分子生物学的检测鉴定方法。 本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定。 2丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息 中文名：丁香假单胞杆菌豌豆致病型。 中文别名：豌豆（细菌性）枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等。 学名:Pseudomonas syringae Van Hall,1902 pv.pisi (Sackett,1916)Young,Dye and Wilkie,1978。 病害英文名：bactrialblightofpea。 异名：Bacteiumpisi（Sackett)Smith,1920;Chlorobacterpisi（Sackett)Patel&Kulkarni,195l; Bergey,et al.,1923. 属原核生物界Procaryotes，变形细菌门Proteobacteria，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，假单 胞杆菌目Pseudomonadales，假单胞杆菌科Pseudomonadaceae，假单胞杆菌属Pseudomonas。 丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A。 3方法原理 依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸 附测定（DAS-ELISA）、基于体外DNA扩增技术的聚合酶链式反应（PCR），以及病菌接种后的致病特征 等进行检测鉴定。 4主要试剂 本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂： 硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、甘油、硼酸、氯化镁、蛋白陈、生理盐水、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris- 盐酸、EDTA，SDS（十二烷基硫酸钠）、CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、溴化乙锭、头孢氨苄、万古霉素、 头孢呋辛酸、溴酚蓝、放线（菌）酮或制霉菌素和PCR相关试剂。 5主要仪器 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器： 超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、 BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪。 1 GB/T28066—2011 6病菌分离 6.1种子样品的制备 检查皱缩种子和其他为害状的种子。每份种子检测样品至少检测2000粒种子。将种子倒入5I 桶内，加3L无菌水，搅拌，用无菌（新）的塑料袋严密封盖，4℃下静置16h～18h或过夜；去掉塑料袋， 充分搅拌。取种子浸出液10mL，用15000g离心5min，用蒸馏水分2次（每次1mL）洗下沉淀物，制 成种子浸出液，以备分离培养。 6.2种子中病菌的分离培养 3个～10个重复，无菌水作为空白对照。 在25℃士2℃下黑暗中培养，3d后开始观察。 如果在培养基上产生可疑菌落（菌落特征见表1)，则将菌落转移至KB平板上划线培养1d～2d进 行纯化（培养基配制见附录B），纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。 表1培养基上的菌落特征 P3 培养基 S4培养基 Pspi的菌落扁平状，白色、透明，边缘不规则 Pspi的菌落较大，半球形，白色，边缘整齐 多数菌株有蓝色荧光 6.3植物组织中病菌的分离培养 仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状（参见图A.1），用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块，加 一滴无菌水，置于载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察。如果观察到细菌的菌脓，则进行分离培养。 选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织切取病斑前沿部分2mm～7mm的组织，用70%酒精表面消 毒15s，无菌水洗2次～3次，在S4和（或）P3培养基平板上划线分离。 在25℃士2℃下黑暗中培养3d后，开始观察。 如果在培养基上产生可疑菌落（菌落特征见表1)，则将菌落转移至KB平板上培养1d～2d进行 纯化，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。 7病菌鉴定 7.1生化鉴定 采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。 7.2DAS-ELISA方法 将可疑菌落配制成10CFU/mL悬浮液，取100uL悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复 一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。 具体操作步骤见附录C。 2 GB/T28066—2011 7.3PCR方法 将可疑菌落制备成108CFU/mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增。或者把可疑菌落接种到NB培养 基中（培养基配制见附录B，25℃士2℃下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增。 用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照。 具体操作步骤见附录D。 7.4致病性测试 如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病 性测试以确认鉴定结果。 将豌豆种子播种于小盆钵中，待长出2片～3片真叶的小苗。取在KB培养基上培养24h～48h 的菌落，用消毒的昆虫针蘸取菌落，在最为幼嫩的秸秆处进行刺伤接种。每个菌落接种5株小苗。 5d～7d后，观察是否产生致病性。如果出现扩展型的水渍状病斑，则有致病性；反之，则没有致病性。 注：有些Pspi的菌株在接种1d～2d后，就引起小苗倒伏。 8 结果判定与检测报告 8.1结果判定 8.1.1未分离到可疑菌落 如果经S4或P3培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出Pspi。 8.1.2分离到可疑菌落 分离培养后的可疑菌落，应经生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法检测，并通过致病性测试的确认。 如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性，致病性测试 也产生典型症状，则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型； 一如果生化鉴定、DAS-ELISA检测或PCR的结果为阴性，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆 致病型； 如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，而致病性测试 为阴性，则应重新进行致病性测试。致病性重新测试后，如果仍然未产生典型症状，则判定为 未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型。 8.2检测报告 检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据，包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌 落形态特征照片、PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等。 3