ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27981—2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时 荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for the detection of infectious bovine rhinotracheitis virus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27981—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）关于牛传染性鼻气管炎/牛传 染性化脓性外阴阴道炎（Chapter2.4.13)的内容。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜焱、吴晓薇。 I GB/T 27981—2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时 荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒（牛疱疹病毒I型，BoHV-1)实时荧光PCR检测方法的技术 要求。 本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织（粘膜、肝、脾、肾、淋巴结、胎盘组织等）和细胞 培养物等样品中BoHV-1病毒感染 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）关于检测牛冷冻精液 中BoHV-1病毒的实时荧光PCR方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BoHV-1:bovineherpesvirustype1,牛疱疹病毒I型。 Ct值：荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环数。 DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸 DTT:DL-dithiothreitol,二硫苏糖醇。 EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸 IBR：bovineinfectiousrhinotracheitis，牛传染性鼻气管炎， PBS:phosphatebuffersolution，磷酸盐缓冲生理盐水。 PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。 SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠。 UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。 4设备和器材 4.1荧光PCR仪。 4.2 台式冷冻离心机。 4.3 可调微量移液器：规格10μL、100μL、200μL、1mL。 4. 4 带滤芯微量吸头：规格10μL、100μL、200μL、1mL。 4.5 PCR光学反应管。 4. 6 微量离心管。 4.7 涡旋混匀器。 4.8 恒温培养箱。 4.9 冰箱：规格2℃~8℃，-20℃，-80℃。 1 GB/T27981—2011 4.10恒温水浴箱。 5试剂 除另有规定，本方法试验用水应按照GB/T6682中规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。 5.1引物与探针 引物与探针配制采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L储存液，置 一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。 引物与探针序列： gB基因上游引物gB-F:5'TGT GGA CCT AAACCT CAC GGT 3" gB基因下游引物gB-R:5'GTAGTCGAGCAG ACCCGT GTC 3' 探针5'端标记的报告荧光基团及3'端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行 选定。 5.2蛋白酶K溶液：配制方法见附录A。 5.3柠檬酸钠缓冲液：配制方法见附录A。 5.40.5mol/LEDTA：配制方法见附录A。 5.50.01mol/LpH7.2PBS:配制方法见附录A。 5.610%chelex100：配制方法见附录A。 5.71mol/LDTT：配制方法见附录A。 5.82X定量PCR-UDG酶预混液：含60U/mL热启动Taq酶，40mmol/LTris-HCl（pH8.4）， 100 mmol/L KCl,6 mmol/L MgCl2,400 μmol/L dGTP,400 μmol/L dATP,400 μmol/L dCTP, 800μmol/LdUTP，40U/mLUDG。可采用经验证可靠的商品化预混液。 5.9核酸抽提试剂盒。 5.10无DNA酶、无RNA酶水。 5.11无水乙醇。 5.12 70%乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制，一20℃预冷。 5.13 三氯甲烷。 5.14 异丙醇。 6样品采集与处理 6.1样品采集及前处理 6.1.1采样工具 SAG 采样工具需经（121士2）℃/0.1MPa高压15min并烘干，或经160℃干烤2h灭菌。 6. 1. 2 血清、全血 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清，直接用于核酸提取。 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇 动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。直 接用于核酸提取。 6.1.3拭子 用无菌棉拭子采集鼻道、生殖器官和眼分泌物，采集时，将拭子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜，蘸 2 GB/T 27981—2011 取分泌物后，立即将棉子浸入1mL~2mL灭菌0.01mol/LpH7.2的PBS中，4℃储存，尽快送达 实验室。取样进行检验时，充分振动、挤干拭子，浸泡液采用4000r/min离心1min，取上清备用。 6.1.4精液 将冷冻精液样品或新鲜精液样品分装到1.5mL微量离心管中，充分解冻后，振荡混匀，采用 酸。每一批次冷冻精液取3支冻精管，分别进行核酸提取和后续检测 6.1.5组织样品 剖检时无菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结，对流产胎儿，采集刚死亡胎儿肝、 肺、肾、脾和胎盘组织。检测时，用无菌剪、镊取适量样品，按1：5的比例加人灭菌0.01mol/LpH7.2 的PBS（例：1g组织样品加5mL溶液），在研钵中剪碎，充分研磨，取研磨物分装到离心管中，冻融2次～ 3次，4000r/min离心5min，取上清备用。 6.1.6细胞培养物 细胞培养物冻融2次～3次，分装到1.5mL微量离心管中，4000r/min离心1min，取上清备用。 6.2样品核酸抽提 6.2.1有机溶剂抽提法 适用于上述各种样品。取200μL经前处理的样品或对照，加200μL0.01mol/LpH7.2PBS缓冲 液，加SDS、蛋白酶K至终浓度分别为1%和0.5mg/mL，混勾器上振荡混匀，56℃温育30min，置沸 水浴孵育8min；加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000r/min，离心10min，取上清；可重复三氯甲烷处 理步骤一次；加等体积异丙醇（一20℃预冷），振荡混勾；4℃，13000r/min离心10min，弃上清；加等 体积70%乙醇，振荡混勾，4℃，13000r/min离心10min；小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒 入50μL无DNA酶、无RNA酶水，轻轻混匀，溶解管壁上的核酸，室温放置10min，直接用于检测，或 贮一20℃备用。长期贮存，应置一80℃或更低温度。 6.2.2Chelex100提取法 采纳世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）操作程序，适用于精 液样品。 在微量离心管中，加人10%chelex100溶液100μL，蛋白酶K(10mg/mL)11.5μL，1mol/LDTT 7.5uL90μL无DNA酶、无RNA酶水，10uL精液样品，充分混匀；置56℃温育30min，充分振荡混 10s；置沸水浴孵育8min，充分振荡混匀10s；用12000r/min离心3min，取上清直接用于检测，或 贮一20℃备用。长期贮存，应置一80℃或更低温度。 6.2.3试剂盒抽提法 可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法。 7实时荧光PCR检测 7.1对照设立 7.1.1样品设置要求：从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。 7.1.2阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的 3