ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28065—2011 地中海实蝇生物芯片检测方法 Biochip detection of Ceratitis capitata (Wiedemann) 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28065—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局， 本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：余道坚、李建光、任鲁风、徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春、康林、仲建忠、 向才玉， GB/T28065—2011 地中海实蝇生物芯片检测方法 1 范围 本标准确定了地中海实蝇Ceratitiscapitata（Wiedemann）（双翅目Diptera实蝇科Tephritidae） 的生物芯片制备、检测和结果判定方法。 本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蛹的鉴定和成虫的鉴定或复核。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2039地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法 3缩略语 SN/T2039界定的缩略语适用于本文件。 4方法原理 选择实蝇科昆虫线粒体DNACOI基因核苷酸片段为分子标记探针，将探针按预先设置的排列固 定于特定的固相支持载体（如：醛基化基片）的表面形成微点阵，利用反向固相杂交技术，用Cy3标记脱 氧胞苷三磷酸（Cy3-dCTP)荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交，实现多个分子之间的杂交反 应，并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在，最后确定是否为地中海实蝇。 5仪器和用具 SZIC PCR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机、水浴锅、涡旋器、冰箱、电子天平、烘箱、磁力搅 拌器。 醛基化基片、多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具、湿盒、杂交盒、计时器、磁柱、芯片架、 2L烧杯，15mL离心管、量筒、移液器等。 6试剂 6.1昆虫基因组DNA提取试剂盒。 6.2DNA快速纯化/回收试剂盒。 6.3去离子水。 6.450%二甲基亚矾（DMSO)。 6.5 0.2%十二烷基磺酸钠（SDS）。 6. 6 0.2%硼氢化钠。 1 GB/T28065—2011 6.7 10XSSPE（20XSSPE:3mol/L氯化钠，200mmol/L磷酸二氢钠，25mmol/LEDTA，pH7.4）。 6.8 0.3XSSC.0.06XSSC（20XSSC:3mol/L氯化钠，300mmol/L柠檬酸钠）。 6.9 10XPCR缓冲液(Mg2+,15mmol/L)。 6.10 dATP,dTTP,dCTP,dGTP(1o pmol/μL)。 6.11 Cy3-dCTP。 6.12 Taq酶。 6.13 引物(10 pmol/μL)。 6.14 探针（50μmol/L）。 6. 15 阳性质粒。 6.16 6乙醇（70%和99.9%）。 6.17 洗液I(0.3XSSC,0.2% SDS)。 6.18 洗液ⅡI(0.06XSSC)。 生物芯片检测方法 7. 1 样品前处理 按照SN/T2039进行。 7.2 基因组DNA制备 按照SN/T2039进行。 7. 3 生物芯片探针 7.3.1检测探针 检测探针包括以下类型的探针（见A.1）： 实蝇科通用探针； 地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针； -地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针； 地中海实蝇种特异探针； 一纳塔尔实蝇C.rosa种特异探针； 非洲芒果实蝇C.cosyra种特异探针。 注1：检测探针是一条20nt～29nt的寡核苷酸；序列为实蝇科昆虫的特异性序列，5端氨基修饰。 注2：实蝇科通用探针能够特异检测实蝇科昆虫，近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种，地中海实蝇、纳塔尔 实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇 7.3. 2 质控探针 质控探针包括以下四种类型探针（见A.2）： 定位点探针； 一阳性对照探针； 阴性对照探针； 空白对照。 7.4芯片制备 7. 4. 1 芯片基片：选择光学级醛基基片。 2 GB/T28065—2011 7.4.2探针稀释：探针用50%DMSO溶解至终浓度为50umol/L，按照探针点阵排布顺序，将探针溶 液用移液器加人多孔板中。 7.4.3点样：用芯片点样仪将探针点至基片上。实蝇芯片探针阵列排布图参见B.1。一张基片四个探 针点阵的示意图参见B.2。 注：每个阵列共5行10列，第1行和第1列为定位点探针，其他探针各设三个重复。每张基片可以根据实际需求点 1个或多个相同探针点阵。 7.4.4水合：基片置湿盒（内盛三分之一体积水），在烘箱37℃水合12h。 7.4.5固定：将基片放在芯片架上，置盛有0.2%SDS溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗5min。取出再放人 盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗3次，每次2-min。 注：漂洗时溶液应没过基片，洗涤时应在洗液中加人磁柱，打开磁力搅拌器搅拌；每漂洗一次，更换去离子水。 搅拌器，静置5min，再磁力搅拌漂洗5min；最后用去离子水磁力搅拌漂洗3次，每次2min。 7.4.7质检：基片置15mL离心管中，2000r/min离心2min除去水分；用芯片扫锚仪对基片进行预 扫描质检，质检合格后芯片避光冷藏保存。 注：基片表面无残余固定剂，探针阵列完整，定位点清晰的为合格的芯片。 7.5荧光标记PCR 荧光标记PCR反应在常规PCR仪上进行，引物P和P序列见C.1标记PCR反应体系见C.2。 扩增条件：94℃90s；94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃5min。待测样品模板DNA和 实蝇阳性质粒平行进行荧光标记PCR，阳性质粒基因序列见C.3。 注：阳性质粒是一段人工合成的DNA片段，其5'端和3°端核苷酸序列分别为引物P：和P的互补链。 7.6杂交反应 7.6.1杂交液预热 10×SSPE芯片杂交液在水浴锅中预热至50℃。 7.6.2变性 分别取杂交液10μL和PCR产物10μL(实蝇模板扩增产物8μL和阳性质粒扩增产物2μL)到一 个灭菌的50uL离心管中，涡旋混匀，在PCR仪上95℃变性5min。 7.6.3杂交 盖上芯片盖片，取变性后的产物20μL加人点样区，芯片用锡箔纸包装，置湿盒中在烘箱46℃避光 杂交3h。 7.6.4清洗 杂交后的芯片依次在42℃预热的洗液I，洗液Ⅱ中磁力搅拌清洗2min。 7.6.5离心 芯片置15mL离心管中，2000r/min离心2min除去水分。 7.7芯片扫描 杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区532nm处进行扫描，PMT值设为800。通过扫描仪软 件获得所有探针阵列的荧光数据。 注：芯片扫描结果存人计算机，扫描后芯片避光室温保存 3