ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28063—2011 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of bean pod mottle virus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28063—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、郑耘、陈青、林石明、陈红运、黄蓬英、吴媛。 I GB/T28063—2011 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定，也适用于传播 该病毒介体昆虫的检测鉴定。 2菜豆荚斑驳病毒基本信息 中文名：菜豆荚斑驳病毒。 英文名：beanpodmottlevirus。 异名：beanpodmottlecomovirus（菜豆荚斑驳病毒），podmottlevirus（荚斑驳病毒），desmodium virus（金钱草病毒）。 英文缩写：BPMV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae、豇豆花叶病毒属Comouirus。 菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A。 3方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录和体外DNA扩增技 术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)进行检测鉴定。 4主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备： 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳 槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器（1000L、200L、 100 μL、20 μL、2 μL)。 5检测样品的制备 5.1DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备 对每批送检样品进行症状检查，优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子（从种脐开始），或者选取 具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片 种子样品：称取0.5g～1.0g的种皮作为检测样品，在液氮中充分研磨，回温后按1：10比例加人 样品提取缓冲液继续研磨。 叶片样品：称取0.5g1.0g的叶片作为检测样品，在研钵中研磨或在液氮中研磨，按1：10比例 加入样品提取缓冲液继续研磨。 把研磨后的样品转移到5mL离心管中，8000r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA（见附 录B)和IC-RT-PCR(见附录C)检测提取液。 注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃中。 1 GB/T28063—2011 5.2RT-PCR检测样品的制备 称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后，利用TRIzol方法提取RNA。（见 附录D中的D.3) 检测与鉴定 6 6.1检测鉴定流程 通常，初筛时采用DAS-ELISA检测方法。当DAS-ELISA产生阳性结果时，再采用IC-RT-PCR 或RT-PCR等方法进行验证。 当首先采用IC-RT-PCR或RT-PCR方法检测时，如果产生阳性结果，则通过实时荧光RT-PCR方 法或序列测定等方法验证。 6.2DAS-ELISA检测 把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的在96微孔板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品 平行加到两个孔中。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用样品提 取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应该尽量与所检测样品相一致。 具体操作过程见附录B。 6.3RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。用健康的植物组织作阴性 对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录D。 6.4IC-RT-PCR检测 把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的离心管中，然后进行RT-PCR扩增。用健康的植 物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录C。 6.5序列测定 将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核 苷酸序列翻译成氨基酸后与已知的BPMV相应序列进行比对，如果与已知的BPMV相应序列同源性 天于75%则判定为BPMV序列，同源性小于75%则判定为非BPMV序列 注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 7结果判定与报告 7.1结果判定 当产生以下检测结果时，则判定为检出BPMV： 判定为检出BPMV； 2 GB/T 28063—2011 当IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为BPMV序列时，则判定为检出 BPMV。 7. 2 结果记录与保存 记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果 保存吸光值的数据报告，IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果保存电泳照片，序列测定结果保存测序报 告图。 3