ICS 71. 040. 99 c 40 GD 中华人民共和国国家标准 GB/T 27765—2011 SiO2、TiO2、Fe3O4 及 Al2O3 纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法 Testing methods of SiO2,TiO2,FesO4 and Al2O3 nanoparticles biological effect by transmission electron microscope(TEM) 2011-12-30发布 2012-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27765—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279）提出并归口。 本标准负责起草单位：中国人民解放军第二军医大学、复旦大学及地科院矿产资源研究所。 本标准主要起草人：杨勇骥、俞彰、周健雄、张天宝。 I GB/T27765—2011 SiO2、TiO2、Fe304及Al203纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法 1范围 技术和规范。 本标准适用于SiO2、TiO2、Fe:O.及Al,O：纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样 超微结构分析。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19619—2004纳米材料术语 ISO/IEC17025:2005检测和校准实验室认可准则（General requirementsforthecompetenceof testing and calibration laboratories) 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 纳米颗粒 nanoparticles 纳米尺度的固体粒子。本标准中出现的纳米颗粒材料特指为SiO2、TiO2、FesO4及Al,O：纳米颗 粒材料。 3. 2 生物效应biological effect 纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化 3.3 生物效应检测biologicaltest 采用生物学、化学、毒理学与医学等领域的实验技术进行检验测量。 3. 4 生物薄试样 thin biological sample 生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为40nm～100nm的生物试样，用于透射电镜观察。 4基本原理 纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚，经分散后与生物体接触。纳米颗粒材料与生物体 接触后，需采用超微结构制样方法，将其制成生物薄试样，在透射电镜下检测纳来颗粒材料作用于生物 1 GB/T 27765—2011 体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化，以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用。用聚焦的 高能电子束照射生物薄试样的微小区域，入射的电子束大部分透过薄试样，形成透射电子，透射电子中 含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子，非弹性散射电子在荧光屏、照相底片或CCD 上成像，形成生物薄试样的超微结构图像。 仪器设备和材料 5 5. 1 仪器设备 5. 1. 1 透射电子显微镜。 5. 1. 2 超薄切片机。 5.1.3 制刀机。 5.1.4 玻璃刀或钻石刀。 5.1.5 恒温烘箱（30℃～70℃）。 5.1.6 超声波清洗仪。 5. 2 材料 5.2.1 戊二醛。 5.2.2 四氧化钱。 5.2.3 乙醇。 5.2. 4 丙酮。 5.2.5环氧树脂。 5.2.6 醋酸双氧铀。 5.2.7 枸橡酸铅。 6 仪器的环境条件 超薄切片机、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求： 6. 1 超薄切片机 6.1.1 切片室应为超薄切片专用房间。 6. 1.2 相对湿度小于60%。 6. 1.3 温度：（20±5）℃。 6. 1. 4 电源电压：220（1土10%）V。 6.2 透射电子显微镜 6. 2. 1 电镜室应为电镜专用房间。 6. 2. 2 相对湿度小于60%。 6.2.3 温度：（20±5）℃。 6.2. 4 杂散电磁场干扰应小于0.1μT。 6.2.5 电源电压及频率应稳定[220（1±10%）V，50Hz士1Hz]。 6.2.6 具备仪器专用地线，接地电阻应小于1002。 2 GB/T27765—2011 7纳米颗粒材料分散 7.1将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和。 7.2放人超声波清洗仪中分散。 注：建议分散的条件：水温（25～30)℃；功率300W；频率40（1土10%）kHz；时间30min左右。 8生物薄试样制备 8.1纳米颗粒材料 8.1.1将不同浓度、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜（一般用火棉胶或Fomvar膜）的3mm透 射电镜专用载网上。 8.1.2将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放人恒温烘箱中，60℃烘烤2h。 8.2生物组织 8.2.1取材：将生物组织在（2～3）%戊二醛固定液（4℃）中迅速切成小于1mm²的小块。配制戊二 醛固定液可参考附录C。 8.2.2前固定：将小块组织浸泡在20倍体积、4℃的（2～3）%戊二醛固定液中固定（1～4)h，用缓冲液 充分漂洗。 8.2.3后固定：将生物小块组织浸泡在1%钱酸，4℃固定2h。配制钱酸可参考附录D。 8.2.4脱水：用乙醇或丙酮梯度脱水。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%乙醇 各一次；90%丙酮1次，100%丙酮3次；每次（10~15）min。 （或硅胶包埋板）内进行包埋。建议浸透比例为，丙酮：包埋剂（浸透时间）：1：1[（1～2)h]；1：2（12h）； 纯包埋剂（1 h）。 8.2.6聚合：在恒温烘箱内进行聚合，37℃聚合12h后，升温至60℃聚合（36~48)h。 8.2.7修块：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状， 8.2.8超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，厚度一般要求在（40100)nm。 8.2.9染色：采用醋酸铀和枸橡酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检。 8.3培养细胞 8.3. 1 前固定：用橡皮刮将细胞从培养血底部刮下或胰酶消化下来，低速离心（800g，5min）成小团 块，弃上清，沿管壁加人（2～3）%戊二醛固定液，放人4℃冰箱固定（1～4)h。用缓冲液充分漂洗。 8.3.2后固定：经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后，加入1%钱酸，放人4℃冰箱固定1h。 8.3.3脱水（同8.2.4)。 8.3.4包埋（同8.2.5）。 8.3.5聚合（同8.2.6)。 8.3.6修块（同8.2.7)。 8.3.7走 超薄切片（同8.2.8）。 8.3.8染色（同8.2.9）。 3