ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27634—2011 传染性囊病病毒核酸检测方法 Protocol of nucleic acid detection for infectious bursal disease (gumboro disease)virus 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27634—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业 大学、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、北京盈九思科技有限公司。 本标准主要起草人：秦智锋、孙洁、卢体康、花群义、陈书琨、吕建强、杨素、方兴旺、曾少灵、詹爱军、 毕英佐、陈兵、阮周曦、朱玉兰。 I GB/T 27634—2011 传染性囊病病毒核酸检测方法 1范围 本标准规定了传染性囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检测方法的技术要求和操 作规范。 本标准适用于传染性囊病病毒感染的快速诊断。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环数。 IBD：infectiousbursaldisease，传染性囊病。 IBDV：infectiousbursaldiseasevirus，传染性囊病病毒。 SPF：specificpathogenfree，无特定病原体 4材料与试剂 4. 1 仪器与耗材 4. 1. 1 核酸电泳仪。 4. 1.2 凝胶成像仪。 4. 1. 3 冷冻离心机（最高离心力达15000g以上）。 4. 1. 4 混匀器。 4. 1.5 °(0。08-*。02-*0。8~0.2)收 4. 1. 6 微量可调移液器（10μ，100μL，1000μL）。 4. 1. 7 微量带滤芯吸嘴（10μ，100μ，000μ）。 4. 1.8 灭菌研钵。 4. 1. 9 离心管。 4. 1. 10 PCR光学反应管。 4. 1. 11 PCR仪。 4. 1. 12 实时荧光PCR仪。 1 GB/T27634—2011 4.2试剂 4.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为 分析纯。 一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。 4.2.3灭菌双蒸水。 4.2. 4 三氯甲烷。 4.2.5异丙醇。 4.2.6无水乙醇。 4.2.7 75%乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，一20℃预冷 3DL2000 DNA Marker. 4.2.8 4. 2.9 一步法RT-PCR检测试剂盒。 4.2.10 一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。 5生物安全要求 5.1采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。 5.2IBDV核酸检测方法的实验室规范（参见附录A）。 6样品的采集 6.1按照GB/T18088的要求进行样品的采集。 囊液等。 7核酸抽提 7.1酚三氯甲烷抽提法 7.1.1取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。 液）、阳性对照（标准的IBDV毒株）各200μuL，再加入200μL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s，于4℃ 12000g离心15min。 SZIC 7.1.3取无RNA酶的1.5mL离心管，加入一20℃预冷400μL异丙醇，吸取本标准7.1.2各管中的 上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。 7.1.4于4℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加600μL75%预冷乙醇， 洗涤。 7.1.5于4℃12.000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。 7.1.610000g离心10s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min~10min。 7.1.7加入15L无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000g离心5s，冰上保存备用。若需长期保 存应放置一70℃冰箱。 2 GB/T 27634—2011 7.2其他核酸抽提法 核酸提取可以采用等效RNA提取试剂及方法，如采用自动化核酸抽提工作站来抽提核酸。 8RT-PCR检测 8.1引物 8.1.1针对A片段VP2基因的引物 E游 U3:5-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3' 下游 L3:5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3 8.1.2针对B片段VP1基因的引物 上游+290: 5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GAA-TTC-AGA-TTC-TGC-AGC-CAC-GGT-CTC-T-3 下游-861: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-CTG-CAG-TTG-ATG-ACT-TGA-GGT-TGA-TTT-TG-3" 8.1.3引物组成的说明 8.1.3.1通用引物M13或R13（黑体部分）序列。M13或R13序列为多数测序反应中的测序引物，便 于对PCR扩增产物测序。 8.1.3.2限制性内切酶位点（下划线部分）。限制性内切酶位点的引人，使得IBDV经RT-PCR扩增 后的产物可用限制性内切酶SphI（引物U3）、EcoRI（引物L3和十290）PstI（引物一861)进行酶切后加 人质粒中。引物U3和L3分别对应AccNoX84034毒株序列片段A的657一676和1193一1212位 置，引物十226和一793分别对应AccNoAF240687毒株序列片段B中的290一311和861一883位置。 8.1.3.3IBDV特异性序列（斜体部分）。A片段扩增产物为604bp，B片段扩增产物为642bp，引物 扩增片段适合进行IBDV分子分析和分子流行病学研究。 8.2反应液的配制 按照商业化的一步法RT-PCR试剂盒推荐说明书，进行IBDVRT-PCR反应液的配制（参见附录B）。 将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。 8.3加样 PCR管放人PCR检测仪内，记录样本放置顺序。 8.4PCR扩增检测 8.4.1在扩增检测区进行。 8.4.2PCR反应条件为： 第一步：反转录50℃45min； 第二步：94℃5min（如果为热启动一步法RT-PCR试剂盒，则需要95℃15min）； 第三步：94℃30s，54℃45s，72℃1min30s，5个循环； 第四步：94℃30s，64℃45s，72℃1min30s，30个循环； 第五步：72℃延伸10min。 3