ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27539—2011 动物流感检测 IA型流感病毒 通用荧光RT-PCR检测方法 Animal influenza detection-Method of real-time RT-PCR for detection of influenza virus A 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27539—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫 局、深圳匹基生物工程有限公司。 本标准主要起草人：汪琳、林志雄、周琦、高志强、陈茹、乔彩霞、蒲静、杨伟、梁成珠， I GB/T27539—2011 动物流感检测A型流感病毒 通用荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法 本标准适用于活动物及其产品中A型流感病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 SN/T1330进出口生、熟毛皮检验规程 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（Ctvalue） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） PBS：磷酸盐缓冲液（配方见附录A)（phosphatebuffersaline） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction) 4原理 流感病毒（influenza virus）属正粘病毒科，根据抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲 （A）、乙（B）、丙（C）型。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定，仅感染人类；甲（A）型抗原变异性最强， 感染人类和其他动物，常引起世界性大流行。编码基质蛋白的M基因是A型流感病毒共有且较保守。 针的5端标记报告荧光基团（R），3端标记率灭荧光基团（Q）。在PCR退火阶段，一对引物和一条探针 同时与目的基因片段结合，探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的 荧光信号；在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下沿着模板链合成新链，当链的延伸进行到探针结合 部位时，受到探针的阻碍而无法继续，Taq酶发挥5'-→3外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，标 进行，PCR产物量与荧光信号呈现正比关系。 1 GB/T 27539—2011 5材料与试剂 5.1仪器设备 5.1.1荧光PCR检测仪。 5.1.2高速微型离心机（离心速度12000r/min以上）。 5.1.3台式高速离心机（离心速度3000r/min以上）。 5.2试剂 5.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682的要求。所有试剂 均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。 5.2.2DEPC水(见附录B)。 5.2.3 Trizol。 5.2.4氯仿。 5.2.5 异丙醇：-20℃预冷。 5.2.6 PBS：（121士2）℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000U/mL。 5.2.7 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。 5.2.8 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液体系组成及使用注意事项见 附录 B。 6抽样 6.1采样工具 下列采样工具应该经（121土2)℃，15min高压灭菌并烘干： 棉拭子； 剪刀； 一镊子； SAC 一注射器； 1.5mL离心管； 研钵。 6.2样品采集 6.2. 1 活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： 取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取鼻腔分泌液； 取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取咽喉分泌液； -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； 将采样后的拭子分别放入盛有1.0mLPBS的1.5mL离心管中，加盖、编号。 6.2. 2 脏器或肌肉组织 用无菌镊子采集待检脏器或肌肉组织，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。 2 GB/T27539—2011 6. 2.3血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。 6.2.4动物皮 采样方法按照SN/T1330，将待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。 6.3样品贮运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封， 24h内送实验室。 6.4样品处理 6.4.1拭子 样品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，3000r/min离心5min，吸取上清 液1mL转入无菌的1.5mL离心管中备用。 6.4.2脏器或肌肉组织 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混勾，4℃，取上清液 1mL转人无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 6.4.3动物皮 研磨后，加10mLPBS混匀，4℃3000r/min离心5min，取上清液1mL转人无菌的1.5mL离心管 中，编号备用。 6.5样品存放 制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反 复冻融（冻融不超过3次）。 7操作方法 7.1家 实验室设置标准与生物安全管理 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测按照GB/T27401,GB19489,GB/T19495.2的规定。 7.2样品核酸提取 的和，编号。 7.2.2每管加入600μLTrizol,分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200μL，混匀，再加人 200μL氯仿，上下颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。 7.2.3取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇（一20℃预冷），做标记。吸取 本标准7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，吸取上清液，不能吸出中间层，颠倒混匀。 3