ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27531—2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合 酶链式反应（RT-PCR)检测方法 Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for the pathogen of viral encephalopathy and retinopathy 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27531—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 本标准主要起草人：刘、卢体康、何俊强、史秀杰、郑晓聪、贾鹏、叶奕优、杨锦舜。 I GB/T 27531—2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合 酶链式反应（RT-PCR）检测方法 1范围 本标准规定了病毒性脑病和视网膜病（viralencephalopathyandretinopathy，VER）病原分离和逆 转录聚合酶链反应（RT-PCR)检测方法。 本标准适用于VER病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用干本文件， GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变（cytopathiceffect） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyammoniumbromide） DEPC：焦碳酸乙二酯（diethypyrocarbonate） EB：漠化乙锭（ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-（2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonicacid] RNA：核糖核酸（ribonucleic acid) RNasin：核酸酶抑制剂（ribonucleaseinhibitor） VER：病毒性脑病和视网膜病（viralencephalopathyandretinopathy） 4试剂和材料 4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶。 4.2 VERV病毒参考株。 4.3 胰酶-EDTA混合消化液（见附录A中A.1)。 4.4L-15培养液（见附录A中A.2)。 4.5 SSN-1细胞系：用L-15培养液25℃培养。 4.6 E-11细胞系：用L-15培养液25℃培养。 4.7 AMV逆转录酶：20U/μL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.8 RNasin：20U/μL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.9 胰蛋白酶。 1 GB/T27531—2011 4.10Taq酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.11dNTP:含dCTP,dGTP、dATP,dTTP各10mmol/L. 4.12 2引物：用于RT-PCR反应的引物浓度为40μmol/L。其序列如下： VERV-F:5'-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3' VERV-R:5'-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3 4.13乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.14氯仿：分析纯。 4.15矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。 4.16 6分子量标准。 5 器材和设备 5.1 96孔细胞培养板。 5.2 倒置显微镜。 恒温培养箱。 5.3 5. 4 普通冰箱和超低温冰箱。 5.5 组织研磨器（研磨器处理参见附录B)。 5.6离心机和离心管（离心管处理参见附录B)。 5.7 PCR扩增仪 5. 8 水平电泳仪。 5. 9 微量移液器及吸头（吸头处理参见附录B）。 5.10 紫外照射仪或凝胶成像仪。 5. 11 制冰机。 VERV的分离 6 6.1菜样 待检测鱼，体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm6cm的鱼苗取头部和内脏（包括肾），体长 大于6cm的鱼取脑、眼、脾牌和肾。按GB/T18088的标准采样。 6.2样品处理 6.2.1组织处理 用组织研磨器制备组织匀浆，按1：10的最终稀释度用L-15培养液稀释，稀释液中含有1000IU/mL 青霉素和1000μg/mL链霉素，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。7000r/min离心 15min，收集上清液。 6.2.2病毒分离 细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液。对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将 细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃～20℃吸附0.5h～1h后，加 人L-15细胞培养液。两个96孔板分别置于20℃和25℃培养。设2个阳性对照（接种VERV标准 株）和1个空白对照（未接种病毒的细胞）。 2 GB/T 27531—2011 阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用倒置显微镜检查。如果接种了被检匀浆上清稀 释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则 在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻 融一次，以7000r/min、4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天 用倒置显微镜检查。 如果阳性对照也未出现CPE，则应换用SSN-1或E-11细胞和待测样品重新进行病毒学检查。 7VERV的RT-PCR检测 7.1样品处理 将450μL细胞病变悬液冻融后，放入1.5mL的塑料离心管，再加人450μLCTAB溶液（见附录A中 A.3）并混匀，25℃作用2h。 7.2核酸抽提 在含有样品的塑料离心管中加人600μL抽提液1（见附录A中A.4)，用力混合至少30s 12000r/min离心5min，小心取上层水相（约800μL）。再加人700μL抽提液2（见附录A中A.5）， 用力混合至少30s。12000r/min离心5min，小心取上层水相（约600uL）。再加入一20℃预冷的 1.5倍以上体积的无水乙醇，倒置数次混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min， 小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体。37℃干燥20min或抽真空干燥；最后加10μL水溶解 后，作为PCR模板。 7.3变性和退火 在PCR管中加人10μL模板和5μL引物（VERV-F和VERV-R各2.5μL），置于70℃反应 5min。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。 7.4cDNA合成 在上述反应管中继续加人dNTP2uL、5倍逆转录酶缓冲液5μL、RNA抑制剂1μL、逆转录酶 1μL、无菌蒸馏水1.5μL，低速离心后，覆盖50μL矿物油。 将PCR管置于PCR扩增仪。42℃60min反应制备模板的cDNA。反应结束后70℃10min灭 活逆转录酶，立即冰浴 7.5PCR扩增 在上述反应管中再继续加人Taq酶1μL，dNTP1μL，反向引物和正向引物各1μL，25mmol/L 的MgClz（见附录A中A.6)10μL、10倍Taq酶缓冲液（见附录A中A,7)10μL、加水到总体积 100 μL。 混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃4min，再开始35次 4℃保温。 7.6设立对照 7.6.1在7.2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。 7.6.3采用未接种病毒的正常 SSN-1细胞抽提核酸作为阴性对照。 3