ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27527—2011 禽脑脊髓炎诊断技术 Diagnostic techniques for avian encephalomyelitis 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27527—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、北 京世纪元亨动物防疫技术有限公司、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。 本标准主要起草人：赵振华、赵心力、陈西钊、孙明、金玲、秦爱建、范根成、李瑞刚、乌日罕 I GB/T27527—2011 禽脑脊髓炎诊断技术 1范围 本标准规定了禽脑脊髓炎诊断技术，包括流行病学、临床症状、组织病理学变化、病毒分离、琼脂免 疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验 本标准适用于禽脑脊髓炎的诊断、检疫和流行病学调查。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AE（V)：禽脑脊髓炎（病毒）[avianencephalomyelitis(virus)」 AEV-VR：禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株（AEV标准株）（avian encephalomyelitisvirus-Van Roekel) EIDso：鸡胚半数感染量（egginfectiousdose） FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） H.E.染色：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline) 3流行病学 除鸡易感AEV外，雉鸡、鹤鹑、火鸡和山鸡也可自然感染。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染 维鸡发病率通常为40%～60%、死亡率为10%～80%或更高。不同日龄的鸡一年四季均可感染。随日 龄的增长，鸡对AEV的抵抗力不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和雏鸡发病（垂直传播）；同 时，病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水，引起与其接触的易感鸡发病（水平传播）。自然情 况下4周龄以内的雏鸡（幼禽）对AEV最易感；实验室情况下，1日龄维鸡脑内接种AEV强毒5d7d 后可发病；经胚胎感染的维鸡出壳后潜伏期1d～7d，口服感染或自然接触一般9d～11d后发病。 4临床症状 自然感染和人工感染维鸡的临床症状基本一致，初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视、呈半尊姿势、头颈 偏向一侧、饮水困难，双腿紧缩、叉开或爪蜷缩，以后可出现站立不稳、进行性运动失调、头颈快速震颤等 症状，甚者常因瘫痪、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显症状，有时仅见轻微腹泻，产蛋率下降 10%~40%和种蛋孵化率降低。 5组织病理学变化 5.1材料准备 5.1.1器材 石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、水浴锅、温箱、显微镜等。 1 GB/T27527—2011 5.1.2试剂 10%中性福尔马林溶液、酒精、二甲苯、切片石蜡、H.E.染色液、中性树胶等。 5.1.3样品 临床可疑AE病例的大脑、中脑、小脑、延脑和腰荐部脊髓样品。 5.2操作方法 分别切取小块（0.5cm²~1cm）大脑、中脑、小脑、延脑和腰荐部脊髓样品置10%中性福尔马林溶 液中固定24h～48h。常规制片、H.E.染色、中性树胶封片、光镜观察， 5.3病理变化 5.3.1中枢神经系统典型的组织病理学变化为非化脓性脑脊髓炎，主要包括大脑、中脑、小脑、延脑和 脊髓的变质性变化、血管反应和胶质细胞增生。 5.3.2变质性变化表现为神经细胞变性和神经组织出现小软化灶。变性的神经细胞肿大、淡染或浓 缩，有的呈现中央染色质溶解现象。变性严重的神经细胞和局部神经组织可发生坏死、液化，形成小软 化灶。 5.3.3血管反应表现为血管出现以淋巴细胞为主的围管性细胞浸润，浸润的细胞在血管周围散在或呈 多层围绕，形成管套。 5.3.4胶质细胞增生表现为增生的胶质细胞可出现在变性神经细胞周围形成卫星现象，或进入坏死的 神经细胞中吞噬坏死物形成噬神经原现象。在软化灶处有数量不等的胶质细胞增生和聚集形成胶质 小结。 5.4结果判定 若5.3.2～5.3.4同时出现时则为非化脓性脑脊髓炎的典型病变，若主要出现5.3.3，而5.3.2不 明显时，可能与免疫反应有关，常见于免疫鸡群。 通过流行病学、临床症状和组织病理学变化可对AE做出初步诊断，在初步诊断的基础上，进行病 毒分离（见第6章）。 6病毒分离 6.1材料准备 6.1.1器材 无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器，孵化器、离心机、高压灭菌器、冰柜、生物 安全柜等。 6.1.2试剂 生理盐水、青霉素、链霉素。 6.1.3材料 SPF种蛋、SPF雏鸡。 2 GB/T 27527—2011 6.1.4病料 （可疑)AE病雏脑组织（以发病早期为好）。 6.2操作方法 6.2.1病料的采集与保存 6.2.2病料处理 将病料无菌称量、研磨，反复冻融3次，用无菌生理盐水溶液作1：5稀释制成悬液，并加双抗（双抗 终浓度为1000IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素）。样品经4000r/min离心10min，取上清液即为 自然病维脑组织病毒液，冻存、备用。 6.2.3雏鸡接种 取6.2.2处理好的病毒液，以0.05mL/羽脑内接种1日龄SPF维鸡，待出现AE症状后采血致死， 同上述方法取脑研磨、制备，获得接种病维脑组织病毒液，冻存、备用。 6.2.4鸡胚接种 胚，于37℃孵化箱内孵育至16日龄收毒、观察鸡胚病变（同时设未接种病料的健康对照组）。收毒时， 首先无菌吸取胚液（尿囊液和羊水）然后观察胚体发育情况；检查胚体、胚脑病变；取胚脑、胃、肠、胰腺 称量、研磨、以胚液作1：5稀释，同6.2.2加入双抗、离心，制成鸡胚组织病毒液，即为AE自然发病维 鸡第1代胚病毒液（AEVE）。取AEVE按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊、孵化、收 毒、检查鸡胚病变、制备第2代胚病毒液（AEVE，）。这样连续传代直至传代鸡胚出现病变时，该代鸡胚 病毒液即可作为病毒鉴定用的AE分离毒病毒液。同时可进行病毒某些特性的检测。 与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为：胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩（胚体重减轻）、腿细 爪曲或强直，脑萎缩，皮下、脑、胃肠水肿、出血等。病毒分离后，可通过琼脂免疫扩散试验、中和试验和 间接免疫荧光试验中的任一种方法进行病毒鉴定（见第7章）。 7AE的确诊和病毒鉴定 7.1琼脂免疫扩散试验 7.1.1器材准备 7.1.1.1器材 冰箱、天平、90mm直径的平皿、微量加样器、塑料吸头和打孔器（内径4.0mm、孔间距3.0mm的 7孔梅花样金属打孔器）。 7.1.1.2试剂 禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验冻干抗原（1mL/安瓶）、标准阳性血清和阴性血清、氯化钠、优质琼 脂粉、pH7.20.01mol/LPBS(或生理盐水）、蒸馏水和1%硫柳汞溶液（见附录A）。 7.1.1.3待检血清 无菌翅下静脉采血1mL左右，分离血清，一20℃冰箱保存备用。 3