ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27528—2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR for detection of foot and mouth disease virus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27528—2011 前言 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思 科技发展有限公司。 本标准主要起草人：秦智锋、林祥梅、吴绍强、花群义、卢体康、刘建、陈书琨、吕建强、曾少灵 詹爱军、韩雪清、孙洁、曹琛福、贾广乐、高小博、陈兵、阮周曦、梅琳、张彩虹、陶虹。 1 GB/T27528—2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于口蹄疫病毒的检测与鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB/T18935口蹄疫诊断技术 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本标准。 Ct值：循环阈值（cyclethreshold）。 4试剂耗材和仪器设备 4.1试剂耗材 4.1.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求 4.1.2口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR试剂：一20℃保存，见附录A。 4.1.3引物和探针序列 上游引物（FMDV-F)序列为：5'ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA3。 下游引物（FMDV-R）序列为：5'GCGAGTCCTGCCACGGA3。 TaqMan探针（FMDV-Pb)序列为：5°TCCTTTGCACGCCGTGGGAC3，其5'端和3°端分别标记 FAM和 BHQ。 4.1.4DEPC处理水：见附录B。推荐购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。 4.1.5氯仿：分析纯，常温保存。 4.1.6异丙醇：分析纯，使用前预冷至一20℃。 4.1.775%乙醇：用DEPC水和无水乙醇配制，使用前预冷至一20℃。 4.1.8石英砂：市售化学纯，121℃，15min高压灭菌后备用。 4.1.90.01mol/LPBS,pH7.6~7.8:见附录B。 4.1.10阳性对照为灭活疫苗毒或组织培养灭活毒，一20℃保存备用。阴性对照样品可采用健康的猪 或牛的组织材料。 4.2主要仪器设备 4.2.1荧光PCR检测仪。 4.2.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃，离心速度可达12000g以上。 1 GB/T 27528—2011 4.2.3生物安全柜。 5采样和样品前处理 5.1样品采集、保存及运输 按照GB/T18088和GB/T18935的要求进行。 5.2样品制备 5.2.1样品的制备应符合GB19489规定。 5.2.2用无菌的手术刀采取动物机体组织（如舌、鼻、蹄水泡皮）0.2g~1.0g置研钵中，加入等量灭菌 石英砂充分研磨。其他机体组织（如淋巴结、扁桃体、肌肉等）除去包膜和其他结缔组织，选取内部实质 部分，置研钵中，加入石英砂充分研磨。然后按照1：5比例加人0.01mol/LPBS(pH7.6～7.8），4℃ 浸泡过夜或者一20℃反复冻融2次，每次30min。然后4℃8000g离心5min。 6核酸提取 6.1核酸提取要求 核酸提取应按照SN/T1193进行。 6.2传统酚氯仿法抽提核酸 6.2.1取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。 6.2.2每管加人600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，再加人200μL氯 仿，混匀器上振荡混匀5s，于4℃12000g离心15min。 6.2.3取灭菌的1.5mL离心管，加入一20℃预冷400L异内醇，吸取本标准6.2各管中的上清液转 移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。 6.2.4于4℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加人600μL75%预冷乙醇， 颠倒洗涤。 6.2.5于4℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。 6.2.610000g离心10s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min~10min 6.2.7加人15μLDEPC水，溶解管底的RNA，5000g离心5s，冰上保存备用，若需长期保存应放置 70℃冰箱。 6.3核酸提取等效方法 口蹄疫病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法：如采用自动化核酸抽提仪和配套核 酸抽提试剂进行核酸抽提。 7实时荧光RT-PCR检测 7.1反应液的配制 0.25μLo 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装15uL， 转移至样本处理区。 7.2加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸10μL，盖上管盖，将PCR管放 人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。 2 GB/T275282011 7.3PCR扩增检测 7.3.1反应条件设定 第一步:42℃30min,95℃5min。 第二步：95℃10s，55℃1min，72℃30s，5个循环。 第三步：95℃5s.60℃30s，40个循环，60℃时设置采集荧光 7.3.2荧光素设定 ReportDye设定为FAM，QuenchDye都设定为BHQ，Referencedye设定为None。 结果判定 8 8.1判定前的设置 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超 过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行 分析。 8.2试验成立判定 选用FAM通道进行分析，阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤30，阴性对照没有对数扩增 曲线，而且Ct值为无，二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效。 8.3阳性判定 Ct值≤30的样本为阳性，表明口蹄疫病毒核酸阳性。 8.4阴性判定 Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明口蹄疫病毒核酸阴性。 8.5可疑判定 如果30<Ct值≤40,判为可疑。此时重复扩增检测，如果重复扩增曲线为对数扩增曲线且Ct≤ 40，判为样本阳性，表明口蹄疫病毒核酸阳性；否则判为样本阴性 3