ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27533—2011 犬细小病毒病诊断技术 Diagnostic techniques for canine parvovirus disease 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27533—2011 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：单虎、温建新、熊炜、黄娟、秦晓冰、于鹏程。 1 GB/T27533—2011 犬细小病毒病诊断技术 1范围 本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法 本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑 制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。 2试剂和材料 2.1FK81细胞（猫肾细胞）。 2.20.9%生理盐水：配制参见附录A中A.1。 2. 3 1%猪红细胞液：配制参见附录A中A.2。 2. 4 犬细小病毒阳性血清。 2.596孔"v”形微量反应板。 2. 6 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，-20℃保存。 2.71.5mLEppendorf管。 2. 8 0.2mLPCR薄壁管。 2.9dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存。 2. 10 0引物：浓度为20μmol/L，其序列如下： 上游引物(CPVF):5'GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC3'; 下游引I物(CPVR):5'GTGCACTATAACCAACCTCAGC3。 2.1110%十二烷基硫酸钠：配制参见附录A。 2.12蛋白酶K贮备液：配制参见附录A中A.4。 2.135XTBE电泳缓冲液：配制参见附录A中A.6。 3器材和设备 3. 1 PCR 仪。 3.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。 3.3水平电泳仪。 3.4凝胶成像系统。 4临床检查 4.1临床特征 4.1.1潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40℃以上，粉红色黏稠血样物。 4.1.2病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射 状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味， 4.1.3患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。 4.2病理变化 4.2.1心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。 4.2.2肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹 4.2.3 胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗·肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易 1 GB/T27533—2011 于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。 4.3判定 若临床症状符合4.1.1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化,则可判定疑似犬细小病毒病， 其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行 确诊。 5血凝与血凝抑制试验 5.1血凝试验（HA)的操作方法 5.1.1样品采集活犬的泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样 水浸润后，取上清液待检。 5.1.3于左侧第1孔加50μL待检样品于1.5mLEppendorf管，混合均匀后，吸50μL至第2孔，混 合均匀后，吸50μL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50μL，稀释后病毒稀释度为第1孔 1：2,第2孔1：4，第3孔1：8…·最后12孔为对照。 5.1.4由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液50μL置微型混合器上振荡，使血球与病毒充分混 5.1.5判定结果：以100%凝集（血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底）的病毒最大稀释孔为该病毒血凝 价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。 5.2血凝抑制试验（HI)的操作方法 5.2.1根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。 5.2.2在96孔v形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50uL生理盐 水，11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血清对照。 吸弃50μL，如此稀释后血清浓度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8.. 5.2.4由第1孔至11孔各加50μL，4单位待测病毒液，第12孔50μL血清，混合均勾，置37℃温箱 再作用15min3omin，待4单位病毒已凝集红细胞可观察结果。 5.2.5判定结果：被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者，该病毒为犬细小病毒。 6PCR检测 6.1病料的采集及处理 样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、粪子用少量生理 盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和 阴性对照样品的同样处理。 6.2DNA抽提 取上清液465μL，加人25μL10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴摇 床上放置2h；加入等量的饱和酚溶液500μL，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；加入等量 的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；再加人等量的三 氯甲烷：异戊醇（24：1），振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；最后加入两倍体积的无水乙 醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清，室温干燥后，加入50uL双蒸水溶解沉淀，即得DNA 模板，一20C贮存备用。CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并进行 DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。 2 GB/T27533—2011 6. 3PCR 检测 在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶 72℃、40s进行35个循环；最后72℃、3min。用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板（含 PCR产物和2μL加样缓冲液（6X），参见附录A中A.8，混勾后加人样品孔。在电泳时设立DNA标 准分子量作对照。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。 6.4结果判定 6.4.1经PCR检测,CPV阳性对照样品可扩增出大小为609bp的核酸片段，参见附录B,且阴性对照 样品无扩增条带，否则试验结果视为无效。 毒核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp，则判定犬细小病毒核酸阴性。 6.4.3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性大 于等于90%，则可确诊为犬细小病毒核酸阳性，否则判定犬细小病毒核酸阴性。 6.4.4若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬细小病毒感染阳性， 3