ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27532—2011 犬瘟热诊断技术 Diagnostic techniques for canine distemper 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27532—2011 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民 共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：单虎、黄媚、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶， 1 GB/T27532—2011 犬瘟热诊断技术 1范围 本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT PCR检测的操作方法。 本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组 织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断。 2试剂和材料 2.1改良最低要素营养液（DMEM)培养基：配方参见附录A。 2. 2 非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）。 2. 3 磷酸盐缓冲液（PBS）：配制参见附录A。 2. 4 青霉素、链霉素：配方参见附录A。 2. 5 CDV阳性血清：中和抗体效价1：1024。 2.6 CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清。 2.7 酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白（SPA）。 2. 8 底物溶液：配制参见附录A。 2. 9 过氧化氢甲醇溶液：配制参见附录A。 2. 10 盐酸酒精溶液：配制参见附录A。 2.11 胰蛋白酶溶液：配制参见附录A。 2.12 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，一20℃保存。 2.13 逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U/uL，一20℃保存。 2.14RNA酶抑制剂（40U/μL）：一20℃保存。 2.15 dNTP:含dATP、dGTPdCTP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存。 2.16 6引物：浓度为20μmol/L，其序列如下： 上游引物(CDVF):5' CGA GTC TTT GAG ATA GGG TT 3'; 下游引物(CDVR):5'CCTCCAAAGGGT TCCCATGA3。 2.17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50μmol/L，一20℃保存。 2.18 DEPC水：自配（参见附录A），或购买商品化DEPC水。 2.19 Trizol试剂：4℃保存。 2.20 异丙醇：使用前预冷至一20℃。 2.21 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。 2.22 1.5mL无RNA酶的Eppendorf管。 2.23 0.2mL无RNA酶的PCR薄壁管。 3 器材和设备 3.1细胞培养瓶（中号瓶）。 3.2 二氧化碳培养箱。 3.3 恒温水浴箱（5℃~100℃）。 3.4 普通光学显微镜。 1 GB/T27532—2011 3.50.45μm微孔滤膜。 3.6离心机。 3.7PCR扩增仪。 3.8水平电泳仪。 3.940个小孔的室玻片。 3.10冷冻切片机。 3.11高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。 3.12凝胶成像系统。 4临床检查 4.1临床症状 4.1.1病犬体温升高至40℃以上，鼻流清沸至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。 4. 1. 2 腹下可见米粒大丘疹。 4.1.3病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐， 4.2病理变化 4.2.1新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩；成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。 4.2.2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。 4.2.3中枢神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。 4.2.4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1um～5μm，可在黏膜上皮细胞、网状细胞、 白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现，核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。 4.3判定 若临床症状符合4.1.1或4.1.3且出现4.2.4的病理变化,则可判定疑似犬瘟热，其他临床症状和 病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT-PCR检测 等方法确诊。 5病毒分离 5AG 5.1样品采集和处理 5.1.1活犬可采集泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬可采集肝、脾、肺等组织器官。 5.1.2上述样品用无血清DMEM制成20%组织悬液，10000r/min离心20min，取上清液，经 0.45um微孔滤膜过滤，滤液用于CDV分离。 5.2操作方法 5.2.1细胞培养 用含8%新生牛血清的DMEM培养基在细胞培养瓶（中号瓶）培养Vero细胞，置37℃二氧化碳培 养箱，单层细胞长至80%～90%时，接种样品上清。 5.2.2病料接种 取0.1mL处理好的样品上清接种Vero细胞，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h，加人无血清 DMEM继续培养5d~7d，观察结果。 5.3结果判定 若接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为CDV病原分 离阴性。若Vero细胞培养4d～5d出现细胞病变（如细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形 成合胞体，并在胞浆中出现包涵体），可用免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT-PCR三种方法之一进 行确诊。 2 GB/T 27532—2011 6免疫酶检测 6.1操作方法 6.1.1将CDV标准株和待鉴定的样品分别接种Vero细胞，接种后5d~7d,病变达50%~75%时， 用胰蛋白酶消化分散感染细胞，PBS液洗涤3次后，稀释至1×10个/mL细胞。取有40个小孔的室 玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。密封包装，置一20℃备用。 6.1.2取出室玻片，室温干燥后，每份10倍稀释的CDV阳性血清和阴性血清，每份血清滴加到两个病 毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，置恒温水浴箱37℃孵育30min。 6.1.3PBS漂洗3次，每次5min，室温干燥。 6.1.5PBS漂洗3次，每次5min。 6.1.6将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min~10min。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。 6.1.7吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。 6.2结果判定 6.2.1若CDV阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色，且CDV阳性血清与正常细胞反应 无色，与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色，则判定阴、阳性对照成立。 6.2.2在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈无色，判为 CDV阴性，相应动物犬瘟热感染阴性。 6.2.3在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈无色，而与CDV阳性血清反应 呈棕黄色或棕褐色，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。 7免疫组织化学检测 7.1样品处理 对疑似CD的病死犬或扑杀犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检。不 能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右天小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存， 送检。 7.2操作方法 7.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片机切片风干后用丙酮固定10min～15min，新 鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片（切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱）。 7.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37℃作用20min。 7.2.3胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2min，以便充分暴露抗原。 7.2.4漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。 7.2.5封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10稀释的正常马血清，37℃湿盒中孵育 30 min。 7.2.6加10倍稀释的CDV阳性血清或阴性血清,37℃湿盒中孵育1h或37℃湿盒中孵育30min后 4℃过夜。 7.2.7漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。 7.2.8加1：100稀释的酶结合物，37℃湿盒孵育1h。 7.2.9漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。 7. 2. 10 底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min~10min后漂洗 7.2. 11 从90%乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。 7. 2. 12 试验同时设阳性、阴性血清对照。 3