ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27536—2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 Isolation and identification of swine influenza virus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27536—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 本标准主要起草人：乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰 1 GB/T27536—2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 1范围 本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法。 本标准适用于各种亚型猪流感的病原分离和鉴定。 2 试验材料、试剂 2. 1 剪刀、镊子。 2.2 1mL注射器。 2.3 单道及多道微量移液器、吸头。 2. 4 9～11日龄SPF鸡胚。 2.5 犬肾细胞（MDCK）。 2.6 6孔培养板。 2.7 DMEM培养基。 2.8 HEPES缓冲液（1mol/L储存液）。 2.9 胎牛血清。 2. 10 TPCK-胰蛋白酶（胰蛋白酶经TPCK处理）。 2. 11 2.12 磷酸盐缓冲液（pH5.9)（参见附录A中A.5）。 2. 13 0.85%生理盐水（参见附录A中A.2）。 2.14 阿氏（Alsevers)液（参见附录A中A.3）。 2. 15 0.5%红细胞悬液（参见附录A中A.4）。 2.16 胎球蛋白（参见附录A中A.6)。 2. 17 过碘酸盐（参见附录A中A.7)。 2. 18 亚砷酸盐（参见附录A中A.8) 2.19 硫代巴比妥酸（参见附录A中A,9）。 2.20 无菌蒸馏水或去离子水。 3仪器 3.1 生物安全柜（柜内负压，有HEPA过滤器可避免细胞培养物污染及保护操作人员安全）。 3. 2 孵化器。 CO,培养箱。 3.3 3.4台式高速冷冻离心机。 3.5 37℃水浴加热器。 3.6 煮沸锅。 3. 7 棉拭子（医用棉签）。 3.8 研磨器。 1 GB/T27536—2011 4样品采集与处理 4.1样品的采集 病死猪，取肺脏或气管分泌物；待检活猪，用棉拭子（医用棉签）采集鼻腔深部分泌物。 4.2样品的保存 样品应置于特定的样品保存液中进行保存。一般采用磷酸盐缓冲液（pH7.0～7.4，0.01mol/L）、 0.85%生理盐水或者不含血清的细胞培养液作为保存液（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/ mL、制霉菌素1000IU/mL，牛血清白蛋白5mg/mL）。样品采集后应置于加冰的保温箱中、密封， 24h内送至实验室进行处理或置一70℃保存。 4.3样品的处理 用剪刀采组织病料置于研磨器中，按质量体积比（1：1）加入样品保存液进行研磨：将棉拭子置于装 有1mL样品保存液的离心管中，用镊子充分挤压后弃去拭子。以上样品室温静置作用30min，4℃ 3000r/min离心5min，取上清作为接种材料。 5样品接种 5.1鸡胚培养 1mL注射器吸取处理好的样品，以0.2mL/胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种9～11日龄SPF 96h将鸡胚制冷后，无菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液和羊水。 5.2细胞培养 在生物安全柜中操作，将60%～80%长满单层的MDCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液（不 含胎牛血清，含有TPCK处理的胰酶2μg/mL的DMEM培养基）洗三次，加人适量的处理样品，置于 5%CO2，37℃培养箱中培养1h～2h，期间每隔30min轻轻摇动一次。感作完毕，弃去感作物，用含 有胰酶的培养液洗三次，加入适量的细胞维持液，5%CO2，37℃培养箱内继续培养5d～7d，期间观察 细胞病变（CPE)的形成情况。如出现CPE(特征病变为：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或 54 破裂，严重时细胞部分或全部脱落），收集细胞培养上清。 5.3结果判定 收获鸡胚液或细胞培养上清，测定其血凝活性（具体操作见6.1）。若HA反应阳性说明可能有粘 病毒科的病毒，应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定；若无血凝活性或血凝价很低，应盲传3～5代 若仍阴性，则认为病毒分离阴性。 6亚型鉴定 6.1HA试验 6.1.1在微量反应板的1~12孔均加人0.05mLPBS,换吸头。 6.1.2吸取0.05mL待鉴定病毒液，加人第1孔，反复抽打3~5次混匀。 2 GB/T 27536—2011 释至第11孔，从第11孔吸取0.05mL弃之，换吸头。第12孔作为红细胞对照。 6.1.4每孔均加人0.05mL0.5%（体积分数）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人）。 6.1.5轻轻混匀，室温（20℃～25℃）下静置10min~30min后观察结果（如果环境温度太高，可置 4℃环境下）。对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。 6.1.6结果判定：将反应板倾斜45°观察红细胞若没有呈泪滴状流尚，则判为HA阳性；完全血凝（不 流尚）的病毒最高稀释倍数为病毒的HA效价（血凝单位用HAU表示）。反之，判为HA阴性。 6.2HI试验 6.2.1标定参考毒株抗原及待鉴定病毒分别为4HAU(25μL)。 6.2.2在微量反应板的第1~11孔加人0.025mLPBS,第12孔加入0.05mLPBS 11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。 6.2.41～11孔均分别加人0.025mL4HAU参考毒株抗原及待鉴定病毒，第12孔作为红细胞对照。 室温（20℃~25℃）下静置10min~30min。 6.2.5每孔均加入0.05mL0.5%（体积分数）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入），轻轻混 匀，室温（20℃～25℃）下静置10min～30min后，观察结果（对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果）。 6.2.6结果判定：按照HA试验进行结果判定。如果待鉴定病毒样品的血凝活性被这一亚型阳性血 清所抑制，则该样品判为这一血凝素亚型阳性。（检测结果成立的条件：已知抗原与相应的阳性血清反 应后出现预期的HI效价，同时抗原的反馈标定结果均为4HAU；反之试验重新进行。） 6.3NI试验（全量法以N1和N2分型血清为例） 试管中。 6.3.2将已经确定HA亚型的待检病毒液稀释至HA价为16HAU,每管均加人0.05mL，混匀37℃ 水浴 1 h。 6.3.3每管加人的胎球蛋白溶液（50mg/mL)0.1mL，混匀，拧上盖后37℃水浴16h~18h 6.3.4室温冷却后，每管加人0.1mL过碘酸盐混匀，室温静置20min。 6.3.5每管加人1mL砷试剂（参见附录A中A.8），振荡至棕色消失、乳白色出现。 6.3.6每管加人2.5mL硫代巴比妥酸试剂（参见附录A中A.9），将试管置煮沸的水浴中15min，不 型血清亚型一致。 7注意事项 7.2孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在一些病毒株中可见红细胞从病毒 中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定或置4℃下孵育。 7.3红细胞悬液始终符合标准。 7.4反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，应以无菌操作将试剂分装成小 包装。 7.5冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。 7.6操作过程生物安全注意事项见附录B。 3