ICS 65.120 B 46 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T26428—2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 Method for determination of Bacillus subtilis in feeds 2011-01-14发布 2011-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T26428—2010 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：广东省微生物分析检测中心 本标准主要起草人：朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜姣 GB/T26428—2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 1范围 本标准规定了饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检验方法。 本标准适用于饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测和计数。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005.ISO6497:2002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195—2006，ISO6498：1998，IDT） 3稀释液、培养基及试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当 纯度的水。 3.10.85%灭菌生理盐水。 SAC 3.2营养琼脂(NA)培养基：参见附录A中的A.1。 3.3 革兰氏染色液：参见附录A中的A.2。 3.47%氯化钠生长培养基：参见附录A中的A.3。 3.5 V-P测定培养基和试剂：参见附录A中的A.4。 3. 6 硝酸盐还原培养基和试剂：参见附录A中A.5。 3.7 D-甘露醇发酵培养基：参见附录A中的A.6。 3.8 丙酸盐利用培养基：参见附录A中的A.7。 4 设备和玻璃器皿 除常用微生物实验室设备外，其他设备和玻璃器皿如下。 4.1恒温培养箱：37℃±1℃。 4.2pH计：精度到士0.1个单位 4.3 玻璃或塑料培养Ⅲ。 4.4刻度吸管：标记容量为1mL和10mL，最小刻度分别为0.1mL和0.5mL。 4. 5 玻璃或塑料涂布棒。 4.6 5显微镜：1000倍。 5采样 实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。 1 GB/T26428—2010 样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。 6试样的制备 按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验 7操作步骤 7.1检样制备、初始悬液和十倍稀释 以无菌操作称取试样25g（mL），加入225mL0.85%灭菌生理盐水，均质1min～2min，制成 1：10的初始悬浮液。吸取1：10的初始悬浮液1mL，加9mL0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后 制成1：100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。 7.2接种和培养 选择2个~3个适宜的稀释度，水浴80℃土1℃维持10min，用无菌移液管分别吸取0.1mL，接 种到两个营养琼脂平板（3.2）上。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接 触平血边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被 琼脂吸收。翻转上述平皿置37℃土1℃培养箱中培养48h土2h。 7.3菌落计数及筛选 培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜 采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代 表全血菌落数。典型枯草芽抱杆菌菌落表面粗糙，不透明，不闪光，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不 规则形，灰白色或微黄色。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验 7.4确证试验 7.4.1概述 一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验 7.4.2菌种制备 自平板上挑取单菌落，划线转接培养于营养琼脂平板上，37℃土1℃培养48h土2h。从每一平板 中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。 7.4.3形态观察 将挑选纯化的菌落做革兰氏染色（3.3)镜检。枯草芽孢杆菌细胞应为杆状，有芽孢，芽孢椭圆形，中 生或近中生，芽孢囊不明显膨大。 7.4.4生理生化确证试验 （3.7）和丙酸盐利用（3.8）试验。 2 GB/T26428—2010 7. 4. 5 ：确证结果 枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙，不透明，灰白色或微黄色，细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中 生，芽孢囊不明显膨大，在7%氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露醇产酸，不利 用丙酸盐者可判为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌与类似芽孢杆菌的鉴别特征见表1。 表1# 枯草芽孢杆菌与其他类似芽孢杆菌的鉴别特征 枯草芽孢 地衣芽孢 蜡样芽孢 凝结芽孢 坚强芽孢 迟缓芽孢 巨大芽孢 短小芽孢 项目 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 B.firmus B.lentus B.subtilis B.licheniformis B.cereus B.coagulans B.megaterium B. pumilus 厌氧生长 一 + 十 + 一 V-P + + + + 一 一 一 + 硝酸盐还原 + + + d p d d 淀粉水解 + + + + + + 明胶液化 + + + P + + 丙酸盐 + ND ND 利 一 用 柠檬酸盐 + + + d + + D木糖 + d + p + + 产 L-阿拉伯糖 + + p + p + 酸 D-甘露醇 + + d + + d + 7%氯化钠生长 + + d + p p + pH5.7生长 + + d + 一 一 注：十：阳性；一：阴性；d：部分菌株为阳性；ND：未测定。 8 结果计算与报告 8. 1 计算每块板上枯草芽孢杆菌菌落数 计数每块平板上的枯草芽孢杆菌菌落数a，使用式（1）计算： .......(1) A 式中： 一计数每块平板上的枯草芽孢杆菌菌落数； —挑取后经证实为枯草芽孢杆菌的菌落数； b A一一挑取平板上用于验证的菌落数； C一平板上的所有特征菌落数。 最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。 示例： 4×78=62.4 按照GB/T8170数值修约规则得α为62。 3