ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 29585—2013 剪股颖粒线虫检疫鉴定方法 Detection and identification of Anguina agrostis (Steinbuch)Filipjev 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T29585—2013 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国青岛出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：王金成、杨秀丽、崔铁军、张治宇、刘鹏、廖芳、张裕君、牛春敬。 GB/T29585—2013 剪股颖粒线虫检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了剪股颖粒线虫的检疫和鉴定方法。 本标准适用于草籽及其他植物材料中剪股颖粒线虫的检疫及其鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3剪股颖粒线虫基本信息 中文名称：剪股颖粒线虫。 英文名称：bentgrassnematode。 学名：Anguinaagrostis（Steinbuch,1799）Filipjev,1936。 分类地位：线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea），垫刃目（TylenchidaThorne，1949）、粒线 虫科［AnguinidaeNicoll，1935（1926）、粒线虫属（AnguinaScopoli，1777）。 带虫种子、虫瘦、植物病残组织是剪股颖粒线虫传播的主要载体。 剪股颖粒线虫的其他信息参见附录A。 4方法原理 现场检测获取样本，通过显微镜观察和分子生物学方法获取形态和核酸信息鉴定特征，进行鉴定。 5仪器、用具 （10×～80×，具透射光源）、冰箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机（1000r/min～5000r/min）、纯 水仪。 5.2用具：线虫挑针、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液器（1000μuL、100μL、10μL、2.5uL）、钟面血 （g7cm、g9cm）、培养皿（g7cm、9cm）、浅盘、套筛（400目、500目）、改进的贝尔曼漏斗、加热板、打孔 器、解刀。 SA 6试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂或双蒸水。 6.1玻片封固剂、4%甲醛溶液、石蜡。 1 GB/T29585—2013 6.210×PCR缓冲液（一20℃保存）、25mmol/L氯化镁（一20℃保存）、2.5mmol/LdNTPs（一20℃保 液、60%甘油、0.3%溴酚蓝，4℃保存）、溴化乙锭（EB，避光保存）、DNAladdermarker（一20℃保存）。 6.3剪股颖粒线虫rDNA-ITS质粒克隆（一20℃保存）。 7现场检测 7.1抽样 按照SN/T2122抽取进出境的草籽、植物样品。 7.2外观症状的检查和取样 剪股颖粒线虫主要侵染植物的花序，被寄生的小花的颖片、外和内显著伸长，其内的子房变成 雪茄状的虫瘦；虫瘦开始形成时为绿色，后变为褐色。收集上述可疑的草籽、植物材料带回实验室检验。 8实验室检验 8.1线虫分离 8.1.1浅盘和漏斗法：直接分离待检样品，室温（25℃左右）条件下分离12h～24h，可获得线虫。 8.1.2人工筛检虫瘦：对于草籽，除浅盘和漏斗法直接分离样品外，可根据剪股颖粒线虫危害寄主引起 的症状特点人工挑栋虫瘦，获得虫瘘后，在清水中浸泡1h～2h，体视显微镜下挑针轻压，也可获得 线虫。 8.2显微观察、摄影和测量 在体视显微镜下挑取线虫若干条制成临时玻片在显微镜下镜检，观察线虫的形态结构。同时对线 虫进行拍照、测量。当虫量足够时，拍摄测量的雌虫、雄虫或幼虫数目应在15条以上。 8.3分子生物学检测 对形态学观察可疑的线虫幼虫应进行分子生物学检测。 9鉴定与检测 9.1形态学鉴定 9.1.1粒线虫属形态鉴定特征 成熟雌虫肥大，体型中等到大，长1mm～2.7mm，呈螺旋形。中食道球有瓣：后食道腺膨大，与狭 部之间连续或缢缩，通常覆盖肠，偶尔不覆盖肠。雌虫卵巢前部转折，卵母细胞围绕一中轴多行排列，子 宫柱状部由多行不规则细胞排列构成。雄虫精原细胞多行排列；有引带；交合伞亚端生，长但不伸到尾 端。一般在寄主植物地上部形成虫瘦。 9.1.2剪股颖粒线虫形态鉴定特征 9.1.2.1雌虫：虫体粗壮，经热杀死后向腹面卷曲成螺旋形，角质膜表面环纹细，在成虫的虫体上难于 观察到侧带区。唇区低平，继缩。垫刃型食道，食道前体部圆柱形，中部略膨大，与中食道球连接处稍继 GB/T29585—2013 缩；狭部短而窄；后食道腺发达，梨形，不呈明显耳叶状，不覆盖肠的前端或稍覆盖。前生殖腺发达，卵巢 常折叠2次，卵母细胞围绕一中柱轴状多行排列，受精囊长梨形，与输卵管连接处稍缢缩分开，子宫内常 有多个卵同时存在。后阴子宫囊的长度为肛阴距的一半，内充满精子。尾锥形，尾端锐尖。 9.1.2.2雄虫：虫体比雌虫短而细，经热杀死后一般呈弓形。精巢常回折1次，精母细胞多行排列。交 合刺比小麦粒线虫A.tritici的纤细，近端部向腹面折或不折，引带细线形。交合伞亚端生。尾端锐尖。 9.1.2.32龄幼虫：除生殖系统未发育及虫体较小外，其余形态结构与成虫相似 9.1.2.4近似种：小麦粒线虫A.tritici。两者的区别是：小麦粒线虫尾端钝圆，交合刺中部明显增粗， 基端头状突腹折，引带槽状，寄生小麦和燕麦；而剪股颖粒线虫则是尾端尖，交合刺中部仅略增粗，基端 头状突不腹折或略腹折，引带细线状，寄生牧草。 9. 1.3 剪股颖粒线虫形态特征图 参见附录B。 9.1.4剪股颖粒线虫测计值 见表1。 表1 剪股颖粒线虫形态测量数据 测量项目 剪股颖分离物 早熟禾和假梯草分离物 和参数 雄虫 雌虫 雄虫 2龄幼虫 雌虫 2龄幼虫 L/mm 1.39~2.60 1.05~1.45 0.55~0.82 2.52~4.14 1. 54~2. 31 0.81~1.25 a 13.8~25.4 23.8~30.0 47.2~65.0 21.8~30.7 21.6~34.4 43.5~71.0 b 12.6~28. 7 6.5~8.9 3.2~4.5 10.3~26.5 6.8~11.6 4.0~6.1 25.2~43.0 21.5~28.4 11.7~20.0 28.8~48.9 20.4~32.7 12. 1~15. 4 c V 87~92 90~92 一 口针/μm 10~12 10~12 10 10~12 10~12 10 交合刺/μm 25~32 30~37 13~15 引带/μm 10~13 注：L：线虫体长：α：体长/最大体宽：b：体长/虫体前端至食道腺与肠连接处的距离；c：体长/尾长； V：虫体前端至阴门的距离X100/体长。 9.2 分子生物学检测 见附录C。 10结果判定 符合9.1形态特征的粒线虫成虫，可判定为剪股颖粒线虫；符合9.1形态特征的粒线虫幼虫，经9.2特 异引物扩增获得的PCR产物约为500bp，同时阳性对照的PCR产物约为500bp，空白对照无PCR产物 时，也可判定待检线虫为剪股颖粒线虫。 3