ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 29577—2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法 Detection and identification of Ditylenchus destructor Thorne 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T29577—2013 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：江丽辉、李一农、汪万春、李芳荣、赵汗青、吕玉峰、韩晶、龙海、高文娜、边勇 GB/T29577—2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了腐烂茎线虫（DitylenchusdestructorThorne）的检疫鉴定方法。 本标准适用于蔬菜和花卉的块茎、鳞茎、球茎等根茎部分，其他寄主植物种子、茎、叶及栽培介质中 腐烂茎线虫的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1141—2002鳞球茎茎线虫检疫鉴定方法 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T 1158 进出境植物盆景检疫规程 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3腐烂茎线虫基本信息 中文名：腐烂茎线虫；马铃薯腐烂茎线虫。 英文名：potatorotnematode;tuberrotnematode。 学名：DitylenchusdestructorThorne,1945。 腐烂茎线虫隶属于线虫门Nematoda（Rudolphi，1808）Lankester，1877，侧尾腺纲Secernenteavon Linstow，1905、垫刃目TylenchidaThorne，1949、粒线虫科AnguinidaeNicoll，1935（1926），茎线虫属 DitylenchusFilipjev,1936 腐烂茎线虫主要通过寄主植物的块芭、鳞茎、球茎及栽培介质进行远距离传播。 腐烂茎线虫的其他信息参见附录A。 4方法原理 采集疑似寄主植物材料进行线虫分离，用显微镜观察分离到的线虫，依据腐烂茎线虫的雌虫和雄虫 的形态学特征进行形态学鉴定，双重PCR分子生物学检测方法是腐烂茎线虫的重要辅助鉴定手段。 5仪器用具 5.1仪器 生物显微镜（100X～1000X）、体视显微镜（10X～80X，具透射光源）、冰箱、电热恒温箱、PCR仪、 电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机（1000r/min5000r/min）、纯水仪。 5.2用具 改进型漏斗分离器、移液器（10μL、25μL、100μL1000μL）；其他用具参见SN/T1141一2002中 1 GB/T29577—2013 的第3章所列的用具。 6试剂 6.1形态学鉴定用试剂 参见SN/T1141一2002中的第4章所列试剂。 6.2分子检测试剂 SAC WLB（500mmol/L氯化钾、10mmol/LTris-盐酸、pH8.0、15mmol/L氯化镁、1.0mmol/L DTT、4.5%吐温20）蛋白酶K（600mg/mL）、10XPCR缓冲液（一20℃保存）、25mmol/L氯化钙溶 液（一20℃保存）、dNTP（10mmol/L）、Tag酶（5U/uL，一20℃保存）、6X载样缓冲液、TAE或TBE 电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝载样缓冲液（6XTAE缓冲液，60%甘油，0.3%溴酚蓝；4℃保存）、溴化乙 锭（EB，避光保存）、DNAladdermarker（一20℃保存）、DNA凝胶回收试剂盒（室温保存）、EcoRI酶 （一20℃保存）、大肠杆菌DH5α感受态细胞（一70℃保存）、质粒提取试剂盒（室温保存）。 7现场检测 7.1检查 对植物进行检查，注意植物地上部分是否有生长不良，叶色失绿、黄化，植株矮化等症状；块茎、鳞 茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤，做 好记录，写上标签，带回实验室检验。 7.2抽样 应有针对性地抽取具有可疑症状的样品，分别用塑料袋装好，加贴标识；带回实验室后，打开袋口透 气，适当保温，放在20℃～25℃室内待检。 对于无可疑症状的样品则按要求随机抽样，具体抽样比例按照SN/T1157、SN/T1158和SN/T2122 中的规定进行抽样。 8实验室检验 8.1 线虫分离 采用两种方法进行分离：浅盘分离法按照SN/T1141一2002中B.2中对对线虫分离的要求进行 改进型漏斗法参见附录B。 8.2标本制作 见SN/T1141一2002中的附录C。 8.3显微观察、描述和测计 在显微镜下，对线虫进行形态观察、描述和测计。 8.4分子生物学检测 对形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测（见附录C）。 2 GB/T29577—2013 9形态学鉴定 9.1茎线虫属形态鉴定特征 9.1.1总则 茎线虫属的雌虫和雄虫，其尾形非常相似，呈长圆锥形到近柱形，偶尔丝状，多数（尾长－肛门或 泄殖腔处体宽）为4～7，寄主不形成虫瘦。 9. 1.2雌虫 9.1.2.1体表特征 9.1.2.2内部特征 口针细小，多数长度为7μm～11um；中食道球有或无瓣，偶尔无明显的中食道球，峡部与后食道 腺之间无缢缩，后食道腺短或长，不覆盖、短覆盖或长覆盖肠 9.1.2.3生殖系统特征 雌虫单生殖腺、前伸，卵巢短或长，有时伸达食道区或转折，卵母细胞一行至两行排列，子宫柱状部 有四排细胞（每排四个细胞）。有后阴子宫囊，且与虫体中线垂直。 9.1.3雄虫 雄虫体表特征和消化系统特征与雌虫相似。雄虫精巢不转折，精细胞大（通常直径3um5um）， 交合伞延伸至尾长的1/4～3/4处，从不伸达尾顶端。交合刺窄细，基部宽大，其上具特殊的突起。 9.2腐烂茎线虫形态鉴定特征 9.2.1雌虫 9.2.1.1体表特征 温热杀死固定后的虫体略呈弓形向腹弯曲，有细微的环纹，体宽约1um，侧线六条，在虫体两端渐 减为两条；唇区低平，略缢缩，唇区框架进行程度较高，侧器孔位于侧唇片。 9.2.1.2内部特征 向后斜。中食道球纺锤形，肌肉发达，有瓣，食道狭部窄，神经环包围处开始膨大为棒状的食道腺体；食 道腺延伸、从背面稍覆盖肠的前端一小段（偶尔缢缩）；偶然亦能见到后食道腺分枝（叉）。排泄孔位于食 道腺位置；半月体刚好在排泄孔前方。 3