ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 280752011 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型 检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas savastanoi pv phaseolicola(Burkholder) Gardan et al. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28075—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准使用重新起草法参考国际种子检验协会（InternationalSeedTestingAssociation，ISTA）的 SeedHealthTestingMethods第7-023号标准《豌豆中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测》编制，与 7-023：2008标准的一致性程度为非等效 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：林石明、陈青、黄蓬英、易建平、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。 I GB/T28075—2011 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型 检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的生物学、血清学和分子生物学的检测鉴定方法。 2萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型基本信息 中文名：萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型（菜豆晕疫病菌）。 学名：Pseudomonas savastanoipv.phaseolicola（Burkholder，1926）Gardan，Bollet，Abu Ghorrah, Grimont &.Grimont, 1992。 病害英文名：haloblightofbean 同物异名：Bacteriummedicaginisvar.phaseolicola(Burkholder)Link&Hull,1927 Bacterium puerariae Hedges,1927 Phytomonas medicaginis(Sackett)var.phaseolicola Burkholder,1926 Phytomonas puerariae(Hedges)Bergey et al.,1930 Pseudomonas medicaginis var.phaseolicola(Burkholder)Stapp &Kotte,1929 Pseudomonas medicaginis f.sp.phaseolicola(Burkholder)Dowson,1957 Pseudomonas medicaginis Burkholder,1926 Pseudomonas phaseolicola(Burkholder)Dowson,1943 Pseudomonas syringae pv.phaseolicola(Burkholder)Young,Dye & Wilkie,1978 Xanthomonas medicaginis var.phaseolicola(Burkholder)Elliot,1951 属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、-变形细菌纲Gammaproteobacteria、假单 胞杆菌目Pseudomonadales、假单胞杆菌科Pseudomonadaceae、假单胞杆菌属Pseudomonas。 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的其他信息参见附录A。 3方法原理 依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸 附测定(DAS-ELISA)、基于体外DNA合成技术的聚合酶链式反应（PCR)以及病菌接种后的致病特征 等进行检测鉴定。 4主要试剂 本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂： 蛋白陈、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、酪胺酸、甘油、硼酸、头孢氨、万古霉素、溴酚蓝、放线 （菌）酮或制霉菌素、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris-盐酸、EDTA,SDS（十二烷基硫酸钠）、CTAB（十 六烷基三甲基溴化胺）、溴化乙锭等PCR相关试剂。 1 GB/T 28075—2011 5主要仪器 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天 平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定仪、酶标仪。 6病菌分离 6.1种子样品的制备 检查种子表面的为害状与异常情况，感病豆荚的种子可能皱缩，种皮有奶黄色的斑块。每份检测样 品至少检测2000粒种子。根据检测种子样品的质量（g），按照1：1.5（质量：体积）的比例，在样品种 子中加人无菌蒸馏水，如500g种子则加入750mL；于4℃～5℃下静置12h~18h。取种子浸出液 10mL，用15550g离心5min，用蒸馏水分2次（每次1mL）洗下沉淀物，制成种子浸出液。 6.2种子中病菌的分离培养 取100μL的种子浸出液涂布于MT和（或）MSP培养基平板（培养基的配制见附录B）。每个处理 至少3个~5个重复，无菌水作为空白对照。 在27℃士2℃下培养，3d后开始观察。发现可疑菌落（菌落形态特征见6.4），将菌落转移至KB 平板上培养1d～2d（培养基的配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR等方 法鉴定。 6.3植物组织中病菌的分离培养 仔细检查症状（参见图A.7），用无菌刀片将感染组织切成细的切块，加一滴无菌水置于载玻片上， 然后盖上盖玻片在显微镜下观察细菌的菌脓。如有，直接蘸取菌脓，或将菌脓转移人1mL无菌水中， 在MT和（或）MSP平板上划线分离（培养基的配制见附录B）。 选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm～7mm的组织，用70%酒精表面消毒 15S，无菌水洗2次～3次，在MT和（或）MSP平板上培养 在27℃士2℃下培养，3d后开始观察。发现可疑菌落（菌落形态特征见6.4），将菌落转移至KB 平板上培养1d～2d（培养基的配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR等方 法鉴定。 6.4菌落形态特征 可疑菌落在KB培养基上划区培养至少20个菌落，在28℃下培养24h～48h，观察有无荧光色素 产生，并进行革兰氏染色及鞭毛染色。菌落在以下培养基上产生如下特征，可以确定可疑菌落。 在MSP培养基上：Psph菌落圆形、隆起、球形、发亮、淡黄色、中央略浅。3d后，菌落边缘的培养基 变成淡黄色（参见图A.6）。 在MT培养基上：Psph菌落奶油状、乳白色、扁平、圆形、直径4.5mm～5.0mm；在紫外光下，多数 菌落产生淡蓝色的荧光（参见图A.7)。 在KB培养基上：Psph的菌落扁平、乳白色和奶油状；3d后，产生蓝绿色荧光。 MSP培养基上培养3d后，菌落边缘的培养基也变成淡黄色。但是，Psph的菌落边缘不整齐。 2 GB/T28075—2011 7病菌鉴定 7.1生化鉴定 采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。 7.2DAS-ELISA方法 一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。 具体操作步骤见附录C。 7.3PCR方法 将可疑菌落制备成10°CFU/mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增。或者把可疑菌落转到NB培养基 中（培养基配制见附录B),在25℃士2℃下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增。 用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照。 具体操作步骤见附录D。 7.4致病性测试 7.4.1概述 如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行 致病性测试以确认鉴定结果。致病性测定采用以下针刺接种法或浸泡接种法。 7.4.2针刺接种 用牙签或解剖针蘸取在KB培养基上有蓝绿荧光的纯化菌落，在弯颈期的小苗上刺伤接种子叶的 近胚轴面。用无菌水接种叶片作空白对照。最少接种10个菌落，每个可疑的菌落接种10株以上小苗， 每株接种至少2个接种点。每次接种前，牙签或解剖针都要消毒。 接种4d～5d后，子叶内部可以见到典型的"油脂”状斑点。如果8d～10d后没有出现症状，则可 判定为非致病菌。 7.4.3浸泡接种 将感病品种的种子播种在苗床或吸水纸上，保湿，25℃黑暗条件下培养2d。 可疑菌落在KB上培养1d~2d后，用无菌水配制成10°CFU/mL的悬浮液。 用解剖针挑开已充分吸水种子的子叶和种皮，在悬浮液中浸泡10min～15min。每个可疑菌落接 种10粒以上种子。设无菌水作空白对照。将浸泡后的种子种植在无菌的土壤中，20℃下高湿培养 5d~7d. 种子萌发后，在子叶上出现“油脂状”的斑点，第一真叶也可能出现症状。如果8d～10d后没有出 现症状，则可判定为非致病菌。 8结果判定与检测报告 8.1结果判定 SAC 8.1.1未分离到可疑菌落 如果经MT或MSP培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生 3