ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28081—2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of tobacco ringspot virus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28081—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌。 GB/T 28081—2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法 鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T1146植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法。 3 烟草环斑病毒基本信息 中文名：烟草环斑病毒。 学名：tobacco ringspotvirus。 缩写：TRSV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Nepooirus病毒。 TRSV的传播途径多样，可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播 烟草环斑病毒其他信息参见附录A。 4方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、体外反转录和体外DNA合 成技术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)进行检测鉴定。 5 仪器设备、用具及试剂 5.1仪器设备 洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平（感量0.001g）、超净工作台、旋涡混合仪、PCR 仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅。 5.2用具 微量移液器（0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL1000μL）、化学PCR反应管和（或）96孔 光化学PCR反应板、酶联板、研钵。 5.3试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂（见B.1）。 1 GB/T28081—2011 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测试剂（见C.1）。 实时荧光RT-PCR检测试剂（见D.1)。 IC-RT-PCR检测试剂（见E.1）。 6种苗的检测鉴定 6.1种子检测鉴定 挑取500粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状 的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定 和分子生物学检测。 也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 6.2苗木、组培苗检测鉴定 有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6.1。 6.3鳞球茎检测鉴定 取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。 6.4植物产品的检测鉴定 植物产品有症状的部分单独检测。没有症状或无法的观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方 法为酶联测定和分子生物学检测。 7检测 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品 平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲 液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应尽量与检测样品相一致。 具体操作见附录B。 7.2RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。 具体操作见附录C。 7.3实时荧光PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行实时荧光PCR检测。健康的植物组织 作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。 具体操作见附录D。 7.4IC-RT-PCR检测 把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的离心管中，然后进行IC-RT-PCR扩增。健康的植 2 GB/T 28081—2011 物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。 具体操作见附录E。 8 结果判定 7.1、7.2、7.3、7.4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒。一 般是酶联测定为阳性后，分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒。必要时可进行生物 接种试验，具体操作按照SN/T1146规定的方法执行。 样品保存、结果记录与资料保存 9 9.1样品保存 经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20℃或 者一80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员 的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状 照片。 SAG 3