ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27637—2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for the detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27637—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有 限公司。 本标准主要起草人：刘中勇、陈茹、杨国海、高云航、曾碧健、朱道中、吴晓薇、高小博。 I GB/T27637—2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了副结核分枝杆菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis）实时荧光PCR检 测方法的技术要求和操作规范。 本标准适用于快速检测培养物、血样、奶样、粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。 DMSO：dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜。 EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 PBS:phosphatebuffersolution，磷酸盐缓冲液。 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。 Taq酶：TaqDNA聚合酶。 UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。 4原理 本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA 的引物，和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5'端标记了被称为报告基团的荧光 素，3端标记了率灭基团。在进行PCR延伸反应时，Tag酶的5’外切酶活性将5”端荧光基团从探针上 切割下来，使其与淬灭基团分离，从而仪器能检测到5端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩 增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测到的荧光信号的累积 反应了扩增产物量的变化。本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板，设计特异扩增 引物和探针建立荧光PCR反应体系。 5材料与试剂 5.1仪器与耗材 5.1.1接种棒。 1 GB/T 27637—2011 5. 1. 2 无菌注射器或真空采血管。 5. 1. 3 灭菌容器。 5. 1. 4 橡胶管。 5. 1. 5 刮匙。 5. 1. 6 荧光PCR仪 5.1.7 恒温水浴锅（室温至100℃）。 5.1.8 离心机（最高离心力达15000×g以上）。 5. 1. 9 混匀器。 5. 1. 10 冰箱（2℃~8℃，-20℃，-80℃）。 5. 1. 11 天平（精密度达千分之一以上）。 5.1.12 微量可调移液器（10uL，100μL，1000uL）。 5.1. 13 微量带滤芯吸嘴（10μL，100μL，1000μL）。 5. 1. 14 研钵。 5. 1. 15 离心管。 5. 1. 16 PCR光学反应管。 5.2试剂 5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水，所用化学试 剂均为分析纯。 5.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L储存液，置 一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。上游引物： 5'GTCAGCGGCGGTCCAG3’，下游引物：5’GCAGCTCCAGATCGTCATTC3'，探针：5²-FAM ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC3'-BHQ-1。 5.2.30.01mol/LpH7.6PBS:配方见A.1。 5.2.4柠檬酸钠缓冲液：配方见A.2。 5.2.50.5mol/LEDTA：配方见A.3。 5.2.6柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见A.4。 5.2. 7 4%氢氧化钠溶液：配方见A.5。 5.2.8 4%硫酸溶液：配方见A.6。 5.2.9 Triton X-100。 5.2.10 DNA提取液：含100mmol/LTris-HCl（pH8.0）,0.01%TritonX-100,200μg/μL蛋白酶K 也可采用等效商品化试剂。 5.2. 11 灭菌双蒸水。 5.2. 12 三氯甲烷。 5.2. 13 异丙醇。 5.2.14 无水乙醇。 5.2.15 70%乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，一20℃预冷。 5.2. 16 6荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl（pH8.3）,2.5mmol/L MgCl2，5%二甲基亚砜（DMSO），5%甘油。可采用等效商品化试剂。 5. 2. 17 dNTP: dATP,dUTP,dCTP 和 dGTP。 5.2.18 Taq酶。 5.2.19 UDG酶。 2 GB/T27637—2011 6生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489一2008的有关规定。 7采样 7.1样品采集 7.1.1培养物 直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量（取用量达到 肉眼可见，菌团大小不超过接种环）菌样，放到0.01mol/LpH7.6PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液， 7. 1. 2 血样 用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清。 用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充 分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。 条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。 7.1.3奶样 无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量较高。 7.1.4粪便 取新鲜粪便，选取腹泻粪便或混有粘液、血液、粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部（约30cm）取 少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。 7.1.5组织 选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结。 7.2样品的保存和运输 待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；一20℃保存不超过三个月；一80℃以下长期保存。样品 应置于低温、密封的容器内运输。 8操作方法 8.1样品前处理 8.1.1血样、培养物（菌液)前处理 取1mL~2mL全血样品，15000×g离心10min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分振荡， 15000×g离心10min弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，继续 进行核酸提取，或置一20℃贮存备用 取1mL～2mL血清、菌液样品，15000×g离心10min，弃上清，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS， 充分振荡混匀，15000×g离心10min；弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃备用。 3