ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27538—2011 动物流感检测 A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 Animal influenza detection-Method of pyrosequencing for HA and NA in influenza virus A (H1N1) 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27538—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、 朱来华、张鹤晓、单虎。 I GB/T275382011 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 1范围 本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型H1N1流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸 序列检测方法。 本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用干本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541动物疫病实验室检验采样方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP：三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate) PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphatebelanced solution） Pyrosequencing：焦磷酸测序 RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction) RNA：核糖核酸（ribonucleicacid） Taq 酶:Taq DNA聚合酶 4原理 焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物（APS）、荧光素孵育，逐一加人四种dNTPs（dATP,dTTP，dCTP， dGTP），如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团（PPi)；ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧 光素发出与ATP量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合检测器（CCD）收集并由软件转化为峰。 每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸 酶降解，萍灭光信号，并再生反应体系。 1 GB/T 27538—2011 5试剂和材料 5.1除特别说明外，本标准所用试剂为分析纯或生化试剂，所有试剂均用无RNA酶污染的器具 （用DEPC水处理）分装，实验用水符合GB/T6682的规定。 5.2焦磷酸测序用引物（对）序列见附录A。 5.3 AMV反转录酶。 5. 4 TaqDNA聚合酶。 5.5 PyroGoldSQAReagentsDNA序列分析试剂盒或其他等效试剂。 5. 6 DNTPs。 5.7 琼脂糖(电泳纯）。 5.8 三氯甲烷。 5.9 异丙醇。 5.10 70%乙醇：配制方法见附录B。 5. 11 DNA分子量标准品（100bp～2000bp）。 5.12 裂解液：Trizol或其他等效总RNA提取试剂。 5.13 PBS:配制方法见附录B。 5.14 10XPCR缓冲液：建议使用厂家提供，如需配制见附录B。 5.15 电泳缓冲液：配制方法见附录B。 5.16 溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。 5. 17 电泳加样缓冲液：配制方法见附录B。 5.18 磁珠悬液。 6 仪器设备 6. 1 焦磷酸测序仪。 6.2 焦磷酸测序仪96孔板。 6.3 真空吸附器。 6. 4 PCR 仪。 6.5 冷冻离心机（最大离心力12000g以上）。 微量移液器。 6.6 6.7 电泳仪。 6.8 紫外检测仪。 6.9 1.5mLEppendorf管。 7采样和样品制备 7.1采样 按照NY/T541和GB/T18088选取样品。样品处理和其他实验活动符合GB19489的有关规定。 7. 2 样品处理 7.2.1鼻腔拭子 样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，3000g离心5min，取上清液 2 GB/T 27538—2011 转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 7.2.2肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃， 3000g离心15min，根据需要取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 7.3样本存放 制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反 复冻融（冻融不超过3次）。 8操作方法 8.1病毒RNA的提取 8.1.1取灭菌的1.5mLEppendorf管，编号。 8.1.2用微量移液器向每管中各加人600μL裂解液，分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照各 200μL，混匀后再加人200μL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀30s。于4℃12000g离心15min。 8.1.3取与8.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人一20℃预冷的500μL异丙醇，做标 记。吸取本标准8.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL。 8.1.4于冷冻离心机上4℃12000g离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体； 加人600μL70%乙醇，颠倒洗涤。 8.1.5于4℃12000g离心10min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，室温干燥。 RNA应在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置一70℃冰箱。 8.2RT-PCR 扩增 8.2.1反转录 在3μL模板中分别加人2μL25mmol/LMgCl2，1μL10×PCR缓冲液，1μL 2.5mmol/LdNTP,0.25μL40U/μLRNA酶抑制剂,0.5μL5U/μLAMV反转录酶,0.5μL 20pmol/μL焦磷酸测序引物对（见附录A)中的RT-PCR上下游引物，用DEPC水补足体积至10μL， 瞬时离心混合。在PCR仪上进行反转录，条件为42℃30min，98℃1min，冷却到4℃。 8.2.2 PCR 反应 8.2.2.1PCR反应体系 在反转录后的10μLcDNA溶液中加人10XPCR缓冲液5μL5U/uLTaqDNA聚合酶 0.25μL,20pmol/μL焦磷酸测序引物对（见附录A)中的RT-PCR上下游引物各0.5μL，DEPC水补 足体积至50μL，在PCR仪上扩增 8.2.2.2PCR循环条件 72℃延伸30s，共循环45次；然后72℃再延伸10min。 3