ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of classical swine fever virus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27540—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。 1 GB/T27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液，排泄物和细胞培养物中CSFV核 酸的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CSFV：猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus） Ct值：达到阅值的循环数（cyclethreshold） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate) HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶（HSTaqDNApolymerase) RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) 荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链式反应（realtimefluorescentquantitativereverse transcription polymerase chain reaction) 4试剂和材料 除另有说明，所用试剂均为分析纯：所有试剂均用无RNA酶的容器分装 4.1Trizol:RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃～8℃保存。 4.2氯仿：4℃预冷。 4.3异丙醇：4℃预冷。 4.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。 4.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC,37℃作用1h，（121士2）℃，高压灭菌15min。 4. 6 RNA酶抑制剂（30U/μL）。 4.7 10XPCR buffer(10 mmol/LpH8.3Tris-HCl,50 mmol/LKCl,1.5 mmol/LMgCl,)。 4.8 dNTP(2.5 mmol/L)。 4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,其序列如下： E游引I物F:5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-3 1 GB/T27540—2011 下游引I物R:5-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3 探针P:5-FAM-CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA-TAMRA-3 4.10反转录酶：SuperscriptⅢ反转录酶（200U/μL）。 4.11DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL)。 4.12阴性对照:DEPC水。 4.13强阳性对照：非感染体外转录RNA（4200pg/μL）。 4.14弱阳性对照：非感染体外转录RNA（42pg/μL）。 5器材和设备 5.1高速台式冷冻离心机：最大离心力12000g以上。 5.2冰箱。 5.3荧光PCR检测仪。 5.4组织匀浆器。 5.5微量移液器和吸头。 5.6离心管。 6样品的采集 6.1采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本不得交叉污染 6.2采样工具 扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5min～10min， 经清水冲洗。 灭菌牙签和0.5mL或1.5mL离心管经（121士2）℃，高压灭菌15min；剪、镊经160℃干烤2h 6.3采样方法 6.3.1活体样品 固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0.5mL或1.5mlL 离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1：5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中 充分研磨，3000g离心15min，取上清液转人离心管中编号备用。 6.3.2内脏样品 采取病死猪各种脏器（淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏）装入一次性塑料袋或其他灭菌容器， 编号，送实验室。取50mg～100mg待检样品，按1：5倍体积加人DEPC水，于研钵或组织匀浆器中 充分研磨，3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。 6.3.34%EDTA抗凝血 用无菌注射器直接全血，注入含1/104%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。 2 GB/T27540—2011 6.3.4排泄物 挑取少许粪便样本于离心管中，加人适量生理盐水，振荡混匀，室温3000g离心15min，取上清液 转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转人离心管编号备用。 6.3.5细胞培养物 细胞培养物冻融3次，转人离心管中编号备用。 6.4存放与运送 采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但 应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h～8h 之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 7实时荧光RT-PCR检测 7.1核酸提取 在样本制备区进行。 7.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数×重复数3十阳性管数+弱阳性管数+阴 性管数，对每个离心管进行编号。 7.1.2每管加入500μLTrizol,分别加人被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各200μL（由于 阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染），颠倒10次混匀，静置5min；再加 人200μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s（也可以用手反复颠倒混匀）。于4℃、12000g离心15min 7.1.3取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加人500L异内醇（4℃预冷），对每个管进行 编号。取7.1.2中离心后的上清液约500μL（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，颠倒混匀， 一20℃静置30min。 7.1.4于4℃、12000g离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸 上，沾干液体，加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。 7.1.5于4℃12000g离心10min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸 上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。 7.1.64000g离心10s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），用微量加样器小心将残余液体吸 干，室温干燥3min~10min。 7.1.7加人38uL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保 存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增；若需长期保存应放置一70℃冰箱。 7.2荧光RT-PCR扩增体系的配制 在反应混合物配制区进行。 设PCR反应数为n，其中n为待检样品数X重复数3+阳性管数十弱阳性管数十阴性管数，每个样 本测试反应体系配制见表1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应 管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。 3