ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27518—2011 西尼罗病毒病检测方法 Diagnostic of west nile virus infections 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T27518—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京百欧赛地生物工程技术开发中心。 本标准主要起草人：杨秀娟、孙福军、丁若愚、田茵、田睿、王飞、杨静 GB/T27518—2011 西尼罗病毒病检测方法 1范围 本标准规定了西尼罗病毒的反转录聚合酶链反应（ReverseTranscription一PolymeraseChainRe- action，RT-PCR）、蚀斑减少中和试验（PlaqueReductionNeutralizationTest，PRNT）和西尼罗病毒的 分离方法。 本标准适用于易感动物的西尼罗病毒病的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ABTSdiammonium2,2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）：2，2-连氮基-双-（3-乙基苯 并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐 AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒（avianmyeloblastosisvirus） BSA：牛血清白蛋白（bovine serumalbumin) CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect) cDNA:互补 DNA(complementary DNA) DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate) DNAdeoxyribonucleic acid:脱氧核糖核酸 dH,O:双蒸水(double distilled water) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate)含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四 种脱氧核糖核苷 EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) 6-FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid） MEM基础培养基(minima essentialmedium) OligodT：多聚T再加上一小段随机碱基（几个碱基）构成的引物，用于RT-PCR PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphatebelancedsolution) PFU：蚀斑形成单位（plaqueformingunits） PRNT：蚀斑减少中和试验（plaquereductionneutralizationtest） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) RNasin：核酸酶抑制剂（RNAenzymeinhibitor） TAE:醋酸盐EDTA(tris-acetate-EDTATris) 1 GB/T27518—2011 Taq酶：耐热DNA聚合酶（thermus aquaticuspolymerase) TAMRA：四甲基罗丹明（carboxytetramethylrhodamine) TRIzol：一种新型总RNA抽提试剂（trizolreagent），可以直接从细胞或组织中提取总RNA Vero细胞：非洲绿猴肾细胞 WNV.西尼罗病毒（westnilevirus） 4试剂 4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶。 4.2TRIzol试剂或其他等效的商品化RNA抽提试剂。 4.3AMV逆转录酶：20U/uL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.45XAMVBuffer:AMV逆转录酶的缓冲液。 4.5F RNasin：20U/uL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4. 6 Oligo(dT):RT-PCR的引物。 4.7 1oXTagBuffer：Tag酶的缓冲液。 4.8 Taq酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化， 4.9dNTP三磷酸脱氧核糖核苷，含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。 4. 10 琼脂糖：电泳级。 4. 11 三氯甲烷：分析纯。 4.12 异丙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.13 75%乙醇。 4.141 PBS：121℃高压15min后，无菌加人青霉素和链霉素至1000U/mL。 4.15 5TAE：24.2gTris碱、5.7lg冻乙酸、0.5mol/LEDTA（pH8.0)10mL，加水定容至100mL，使 用前作50倍稀释，用盐酸调节pH值至7.5~7.8。 4.16WNV标准毒株、WNV阳性对照与WNV阴性对照。 4.17MEM细胞培养基。 4.18Vero细胞。 4.19 胎牛血清。 4.20细胞维持液：含2%~3%胎牛血清、青霉素和链霉素分别为100U/mL的无菌MEM。 4.21中性红水溶液：中性红粉0.1g，用去离子水定容至100mL，pH7.4，高压除菌或0.22μm滤膜过 滤，无菌分装于褐色瓶内，4℃保存备用。 4.222倍浓度不含中性红MEM液：10倍浓度不含酚红的MEM20mL,胎牛血清4mL,青霉素和链 霉素各10000U（μg），去离水定容至100mL，0.22μm滤膜过滤，pH7.2～7.4，4℃保存备用。 4.23不含中性红的营养琼脂：使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43℃～45℃，加人等量 已加温至43℃～45℃的2倍浓度不含中性红MEM液，充分混合均匀，保存在43℃～45℃水浴中 备用。 4.242倍浓度含中性红MEM液：10倍浓度不含酚红的MEM20mL，胎牛血清4mL，青霉素和链霉 素各10000U（μg），中性红水溶液6mL.去离子水定容至100mL.0.22μm滤膜过滤，pH7.2~7.4， 4℃保存备用。 4.25含中性红的营养琼脂：使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43℃~45℃，加入等量已 加温至43℃～45℃的2倍浓度含中性红MEM液，充分混合均匀，保存在43℃~45℃水浴中备用。 4.260.1%过氧化氢。 4.27BSA：一般是在购置PCR试剂中带的，是在反应时保持酶活性的。不是必须的。不用自已配置。 2 GB/T27518—2011 也可不加入反应中。 4.28 30.5mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液：碳酸钠0.32g，碳酸氢钠0.586g，加水溶解，定容至 2 00 mL. 4.29抗马IgM。 4.305%脱脂奶粉：5g的脱脂奶粉溶于100mL的PBS缓冲液中。 4.310.05%tween-20:吐温-20。 4.32辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体。 4.33 Rnase:RNA 酶(RNA polymerase)。 5器材和设备 5.124孔细胞培养板。 5. 2 296孔细胞培养板。 5.3 二氧化碳培养箱。 5. 4 普通冰箱和超低温冰箱：规格2℃~8℃，一20℃，一80℃。 研磨器/研钵。 5.5 5.6 离心机（规格≥15000g）。 5.7 荧光RT-PCR检测仪。 5.8 PCR 仪。 可调移液器。 5.9 5.10 电泳仪。 5. 11 细胞瓶。 5. 12 微型滤器：装有0.22μm滤膜，121℃高压15min。 5.13 5%脱脂乳封板。 6 WNV的分离 6.1实验室生物安全要求 实验室生物安全要求按照附录A执行。 6.2样本采集 疑似死于西尼罗病毒病的动物可考虑采集血液、血清、脑脊液或组织，其中组织样品可优先采取脑 组织和神经组织，其次可采集肾、脾和肝组织。 进行血样采集时避免使用阻碍PCR反应的肝素，可用抗凝剂EDTA采血。 6.3样本运输与储存 血清样本应冷藏，24h内运送至实验室（血清标本可在4℃存放1周，长期保存置一20℃或以下）。 其他样本送至实验室后，病毒分离样本应尽快进行接种分离，48h内进行接种的可置于4℃保存，如未 能接种应置一70℃或以下保存，避免反复冻融。 6.4样本处理 取感染样本送专业实验室检测，样本的储存和运输应保持在低于一70℃中 组织样本取1g~2g在无菌研磨器或研钵中，加5mL~10mL含10%胎牛血清的PBS溶液，磨 3