ICS 65.020.30 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)检测 PCR 法 Polymerase chain reaction (PCR) method for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25878—2010 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人：黄健、杨冰、朱泽闻、宋晓玲、孙喜模、赵红萍、刘莉。 1 GB/T25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)检测PCR法 警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件 1范围 本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）聚合酶链式反应（PCR）检测方法的 原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。 本标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 SC/T7202.1—2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分：压片显微镜检查法 SC/T7202.2一2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分：PCR检测法 3原理 3.1对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征 传染性皮下及造血组织坏死病毒（infectioushypodermaland haematopoieticnecrosisvirus， IHHNV）粒子大小为20nm～22nm，是无囊膜二十面体，在氯化艳中的浮力密度为1.40g/mL，含线 状单链DNA，长度为4.1kb，衣壳由4个分子质量分别为74kD、47kD.39kD、37.5kD的多肽组成。 IHHNV可感染世界各地的养殖对虾，其感染细角滨对虾（Litopenaeusstylirostris）会引起急性传 染病和高死亡率（9o%），稚虾受到的危害最严重。IHHNV感染凡纳滨对虾（Litopenaeusuannamei） 会引起慢性“矮小残缺综合症”（RDS)，主要影响是患病对虾生长缓慢，畸形，受感染存活对虾终生带毒， 通过垂直和水平传播。 3.2技术原理 长度的特异性DNA序列作为模板，以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四 种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用，经过数十次变性、退火和延 伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检 测到被特异性扩增的片段，从而揭示微量IHHNVDNA的存在。 4试剂和材料 4.1所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外，按照SC/T7202.2一2007中第5章的规定。 4.2100ng/μL引物F:5'-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3，-20℃保存。 4.3100ng/μL引物R:5'-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3'，-20℃保存。 4.4阳性对照为已知IHHNV阳性的组织样品的DNA模板，一20℃保存。 1 GB/T 25878—2010 4.6空白对照以无菌双蒸水为模板。 5仪器和设备 所需仪器设备按照SC/T7202.22007中第6章的规定。 6操作步骤 6.1反应体系的准备 6.1.1PCR反应体系的准备应在洁净区完成。 6.1.2PCR反应可选择25μL、50μL或100μL反应体系进行。 6.1.3在PCR前区按表1的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物。保存于 一20℃。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加人相应体积的Taq酶，混匀，即成完 全的反应预混物。按1份/支分装到0.2mLPCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加 入50μL液体石蜡。暂存于4℃。 表1100份PCR反应预混物所需试剂组成 试剂 25μL体系 50μL体系 100μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液（无Mg2+） 250μL 500μL 1 000 μL 1X 氯化镁（25mmol/L） 200 μL 400 μL 800uL 2.0 mmol/L dNTP(10 mmol/L) 100 μL 200μL 400μL 400 μmol/L 100ng/μL引物F 75 μL 150 μL 300μL 3 ng/μL 100ng/μL引物R 75 μL 150 μL 300 μL 3 ng/μL 灭菌双蒸水 1 725μL 3450μL 6.900μL TaqDNA聚合酶(5U/μL) 25 μL 50 μL 100 μL 0. 05 U/μL 100份反应总体积 2450μl 4.900μL 9.800 μL 注1：25μL体系模板量0.5μL/反应管。 注2：50μL体系模板量1μL/反应管。 注3：100uL体系模板量2L/反应管 6.2样品准备 6.2.1样品的处理应在样品区完成。 6.2.2样品采集的要求按SC/T7202.1一2007中附录B的规定执行。 6.2.3活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg～100mg（去掉稚虾眼）。活体 或冰冻的虾鳃、胃、游泳足或步足样品约5mg~100mg。活体或冰冻饵料生物样品约5mg~100mg。 池底表土样品约500mg。将上述待检样品放人灭菌1.5mL微型离心管中，应避免各样品间的交叉污 染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的有效氯含量为3.0X10-3的含氯 消毒剂中5min，经无PCR产物污染的自来水充分清洗，再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品。 6.3DNA的提取 按照SC/T7202.2—2007中7.1.3的规定执行。 6.4PCR扩增 6.4.1在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有1份反应预混物的PCR 管内加入相应体积的各样品DNA提取液，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。 6.4.2将上述加有样品模板的PCR管带人PCR后区，置于PCR仪中按以下程序进行扩增：95℃ 2 GB/T25878—2010 5min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃延伸7min，最后4℃保温。准备进行产物 的电泳。 6.5PCR产物电泳 按照SC/T7202.2—2007中7.1.5~7.1.8的规定执行。 7结果判定 7.1阳性对照和阳性样品在389bp处应有一条特定条带出现；阴性对照和阴性样品在389bp处应无 条带出现，空白对照不出现任何条带。阳性对照在389bp处无特定条带出现或阴性对照在389bp处 有条带出现都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。对虾传染性皮下及造血组 织坏死病毒（IHHNV)PCR检测产物序列参见附录A。 7.2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。 7.3阳性结果表明被检样品中存在IHHNVDNA。对活虾和敏感宿主而言，提示已受IHHNV感染； 对冰鲜或冰冻对虾而言，提示曾受到IHHNV感染。 7.4电泳结果的分析和问题排除方法参见附录B。 3