ICS 65.150 B 51 GB 中华人民共和国国家标准 GB20554—2006 海带 Kelp 自2017年3月23日起，本标准转为推荐性 标准，编号改为GB/T20554-2006。 2006-09-29发布 2006-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 根据中华人民共和国国家标准公告（2017年第7 号）和强制性标准整合精简结论，本标准自2017 GB20554—2006 年3月23日起，转为推荐性标准，不再强制执行。 前言 本标准的第3章为强制性条款，其余为推荐性条款 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。 本标准主要起草人：干飞久、段德麟、刘涛、陈四清、张岩、高淳仁、干东祥、崔竞进 GB20554—2006 海带 1范围 本标准给出了海带（Laminariajaponica Aresch)的名称与分类、主要形态构造特征、生活周期与繁 殖、遗传学特征以及检测方法。 本标准适用于海带的种质监测和鉴定。 2名称与分类 2.1学名 海带(Laminaria japonica Aresch)。 2.2分类位置 褐藻门（Phaeophyta）、游孢子纲（Phaeosporeae），海带目（Laminariales）、海带科（Laminariaceae）、 海带属(Laminaria Lamx.）。 3主要形态构造特征 3.1孢子体外部形态特征 藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分。海带孢子体外部形态见图1。 1——固着器； SAC 2——柄; 3叶片； 4——纵沟； 5——中带部； 6—叶缘部。 图1海带孢子体的外部形态 3.1.1 固着器 由多次双分枝的圆柱形假根组成，其末端有吸盘。 3.1.2柄 呈圆柱形或扁圆柱形，深褐色，成藻柄长3cm～6cm。 3.1.3叶片 带状，褐色具光泽，基部幼时楔形，厚成阶段为扁圆形。养殖的海带成藻一般长2m～4m，宽 20cm~40cm。野生的海带成藻一般长0.8m~1.8m，宽8cm~20cm。有两条浅的纵沟贯穿叶片的 中部形成较厚的中带部，叶片边缘薄而软，有波褶。 1 GB 20554—2006 3.2孢子体内部构造特征 柄和叶片均分三层组织，外层为表皮，其内为皮层，中央为髓部。 3.2.1表皮 由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状。细胞含粒状色素体 3.2.2皮层 外皮层细胞呈柱状，大小不等，排列不整齐。内皮层细胞大小相近，排列较整齐。 3.2.3髓部 由喇叭丝和髓丝组成。 4生活周期与繁殖 4.1生活史 明显的孢子体（2n）与配子体（n）不等世代交替型） 4.2生命周期 海底自然繁生的海带，其寿命为两年。 4.3繁殖 4.3.1性成熟年龄 10个月～12个月。 4.3.2无性繁殖 孢子体产生单室孢子囊群，每个孢子囊内形成32个游孢子。游孢子单细胞，梨形，长6.9um～ 8.2μm，宽4.1μm~5.5μm，有两条侧生不等长鞭毛，前面一条长17.8μum~19.6um，后面一条长 6. 9 μm~8. 2 μm。 4.3.3有性繁殖 卵配方式。雄配子体产生精子囊，每个精子囊产生一个梨形精子。精子长4.4um～6.2um，宽 精子（n）与附着在卵囊口处的卵（n)结合生成合子（2n）。 5遗传学特征 5.1染色体数 孢子体细胞染色体数2n=44。 5.2DNA序列特征 5.2.1ITS-1序列：总长度238bp。 1 CCGAAAGCGG GTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATT GTCTGTGAGG CCGCTTCGTG 121AGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCAC ATTTCAACCC ATTAAACTCT 181GAATCTGAACTCAAAGGGGC GCTGCGCTAGCCGCGGCTCC CCCAACCTTT AACGTTGT 5.2.2ITS-2序列：总长度258bp。 1GACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTT 61GAGTGTTCCG GAGTTCCCATGCTCCGAGTG CACCTAATCT CGTGAACGAA GCCTCTCGCG 121 CCCTGCCGCACAGAGTTGTT GACGGCGCTCGCTTCGGCGG CGACTCTCGA CTCACCAAAC 181GTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCG ACCCTTCTGG GTCAGCGTCG 241 GAAACCGTAC CACTTTCG 2 GB20554—2006 6检测方法 6.1形态构造检验 采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。 6.2染色体检验 6.2.1标本的制备 压片法。 6.2.2染色液 2%（质量分数）地衣红溶于70%（体积分数）的乙酸中。 6.2.3染色方法 固定材料在自来水中浸泡15min~30min后压片。揭开盖片，滴入醋酸地衣红后盖片0.5h，用滤 纸吸出多余的染色液，石蜡封片。 6.3海带ITS序列的检测 6.3.1海带配子体DNA的提取 取约1g（湿重）的海带配子体，加少量石英沙和PVP-40,在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL 的离心管中，加人15mL裂解缓冲液（10mmol/LTris-HCl，1ommol/LEDTA，1.0mol/LNaCl， 1.0%CTAB,1%SDS，pH8.0），在65℃保温1h，期间摇匀几次。用同体积的三氯甲烷十异戊醇 (24十1)抽提一次，再将水相转移至一新的50mL离心管中，加人1/3体积的4mol/LTris-HCl， 1mmol/LEDTA，pH8.0中，加2μLRNaseA，37C保温1h，再用三氯甲烷+异戊醇（24+1)抽提一 次，异丙醇沉淀回收DNA。DNA最后溶于一定体积的TE中，检测DNA的浓度。 6.3.2ITS特异性扩增 总反应体积为20μL，含10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgClz， Taqpolymerase1U,4种dNTP各2mmol/L,两个引物各4mmol/L~6mmol/L,模板DNA10ng， 其余用双蒸馏水补满。 PCR反应参数：96℃预变性5min；96℃、30s，72℃、60s，55℃、30s，37个循环；72℃，保温5min。 6.3.3ITS序列扩增引物 正向引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3。 反向引物:5'-AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC-3°。 6.3.4测序 参照DNA测序仪进行测序，见附录A。 6.4判定规则 以第3章为主，结合第4章、第6章判断检验样品结果。经检验，符合上述质量要求的样品为合格 样品。