ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31810—2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Maize chlorotic mottle virus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31810—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验 检疫局。 本标准主要起草人：张卫东、张永江、张慧丽、干岚、杨翠云、廖力、李曼、迟远丽、徐淼锋、权永兵 闻伟刚、陈其文。 I GB/T31810—2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定的方法 本标准适用于可能携带玉米褪绿斑驳病毒的种子、种苗等植物繁殖材料中玉米褪绿斑驳病毒的检 疫鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964—2011植物病毒检测规范 3仪器设备、设施和主要试剂 3.1 仪器设备 酶标仪、洗板机、普通PCR仪、荧光PCR仪、微量分光光度仪、生物安全柜、高压灭菌锅、培养箱、微 量天平（感量：0.001g）、冰箱、离心机、酸度计、水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（1000μL、 200 μL,100 μL,10 μL、2.5 μL)。 3.2 2设施 隔离温室(10℃～30℃）。 3.3 3主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。主要试剂和缓冲液见附录B中B.1和附录C中C.1。 4抽样和检测样品的制备 4.1抽样 抽样按照SN/T2122的规定执行。 4.2 检测样品的制备 4.2.1种子类 挑取至少500粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）样品，经3%次氯酸钠（NaC1O）表面消毒 10min后，将种子置于灭过菌的土壤中，在适宜的发芽温度（25℃～28℃）条件下催芽，直至长出3片 4片真叶进行检测。选取具有褪绿、畸形等症状的植株幼嫩叶片全部进行编号检测，同时随机抽取至少 20株无症状植株样品进行混样检测。 1 GB/T31810—2015 4.2.2种苗类 对于有症状的种苗类样品单独检测，重点选取表现症状种苗类样品的幼嫩叶片；对于无症状的种苗 类样品至少选取20株的幼嫩叶片进行混样检测。 5检疫鉴定方法 5.1DAS-ELISA检测 照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制，并根据送检样品数量设置待检测样品孔数，要求 每个待测样品设两次重复。所有点样孔都安排在酶联板内部，防止边际效应的发生，影响检验结果的准 确性。 具体操作见附录B。 5.2 2RT-PCR检测 RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照，用感染MCMV的植物组织作阳性对照，用ddH，C 作空白对照，每个反应体系设置两个平行样。 SAC 具体操作见附录C。 5.3实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照，用感染MCMV的植物组织作阳性对照，用 ddH2O作空白对照，每个反应体系设置两个平行样 具体操作见附录D。 6结果判定 样品经DAS-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定样品未检出玉米 褪绿斑驳病毒。 样品经DAS-ELISA检测结果为阳性，进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测。 PCR结果为阴性，判定未检出玉米褪绿斑驳病毒；PCR结果为阳性，可以判定为样品检出玉米褪绿斑驳 病毒。 7样品保存和复核 7.1样品的保存 经检验确定携带MCMV的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，其他繁殖材料采病叶经 液氮干燥后在一80℃条件下保存 7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据，PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片，荧 光PCR检测应附扩增图谱。 N GB/T31810—2015 7.3 3结果复核 检验结果的复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等 资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。 3