ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31808—2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Albugo tragopogonis (Pers.) S. F. Gray 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31808—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、新疆生产建设兵团农业技术推广总站。 本标准主要起草人：张祥林、王独、赵冰梅、王文正、张江国、乾义柯。 I GB/T31808—2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了向日葵白锈病菌的检疫鉴定方法， 本标准适用于向日葵种子和植株中向日葵白锈病菌的检疫和鉴定。 2仪器和用具 生物显微镜、体视显微镜、超净工作台、高压灭菌器、高速离心机、制冰机、全温水浴、PCR扩增仪 吸管。 3试剂 乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、藏红花、次氯酸钠（NaCIO)，十二烷基硫酸钠（SDS），三羟甲基氨基甲烷-盐 酸（Tris-HCI)，氯化镁（MgCl,），乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA），氢氧化钠（NaOH），醋酸钠（NaOAc）， 氯化钾（KCl），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），无水乙醇（Ethanol），苯酚（Phenol），三氯甲烷（Chloro- form），异丙醇（Isopropanol），异戊醇（Isoamylalcohol），核酸染料（SYBRGreenI），蛋白酶K，Taq DNA聚合酶（TaqDNApolymerase），脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），DNA分子量标记（DNA Marker),TAE电泳缓冲液(TAEbuffer)。 4检疫鉴定方法 4.1 田间症状检查 在向日葵现蕾中期至盛花期，到向日葵隔离种植区或大田进行调查，观察向日葵植株发病情况。 4.2种子带菌检查 选取5g癌小的向日葵种子，置于干净三角瓶中，加人200mL清水和少量洗衣粉，在往复式振荡器 上振荡10min，倒去洗涤液，再加人等量的清水，重复洗涤3次～5次，直至洗净向日葵种子上的种衣剂 （如无种子包衣，可省略此步），晾干，剥开向日葵种子，将果皮和种仁一起放人装有乳酚油的烧杯中，酒 精灯下煮沸3min，冷却后在解部镜下用镊子剥取内果皮和种皮，放入一干净培养皿中，加人少量棉蓝 藏红花染色液，静置5h左右，用95%乙醇清洗后，用镊子夹取内果皮或种皮置于载玻片上，加一滴乳酚 油作浮载剂，盖片镜检。 4.3病原菌形态观察 用干净刀片刮取少量向日葵病叶背面（或叶柄、花盘等）的白色疱斑中的病菌，置于载玻片上，在生 物显微镜下观察该病菌形态特征，记录抱囊梗、抱子囊、卵孢抱子的形状及大小。 孢子的形状及大小。 1 GB/T31808—2015 4.4分子生物学检测 4.4.1DNA提取 取向日葵种子或具疑似症状的向日葵病组织，用CTAB法或试剂盒法提取核酸（见附录B)。 4.4.2巢式PCR检测 向日葵白锈病菌的巢式PCR检测方法见B.2。 4.4.3实时荧光PCR检测 向日葵白锈病菌的实时荧光PCR检测方法见B.3。 5鉴定特征 5.1为害症状 向日葵受白锈病菌侵染为害后，在叶片正面产生淡黄色或淡绿色病斑，直径1mm～2mm，叶片背 面相对应的部位形成突起的白色疱斑。疱斑表皮破裂后散出白色粉状物（病原菌孢子囊）。疱斑可相互 汇合，形成大的斑块。田间发病严重时，向日葵叶柄和花盘上也会发病。 5.2病原形态 向日葵白锈病菌菌丝无色，分支，产生短的孢囊梗，（31.48μm~59.19μm）×（6.07μm~16.12μm）。 孢子囊成串产生。孢子囊球形、卵形或多角形，单胞，无色，（16.32um21.18μm）×（15.12μm～ 20.54um）。卵孢子褐色至黑色，壁有刺突，生长在寄主组织（向日葵种子、叶片、叶柄、花盘等）中，大小 （46.57μm~66.82μm）×（45.49μm~65.77μm）。孢子囊在水滴中30min就可萌发，产生游动孢子， 游动孢子直径6um~12μm，具1条鞭毛。经染色后，带菌向日葵种子的果皮和种皮中可观察到蓝色菌 丝体、孢子囊和孢囊梗，以及褐色卵孢子。 向日葵白锈病菌的形态图参见附录C。 5.3巢式PCR检测结果 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，通用引物NL1/NL4首轮PCR扩增片段 大小为700bp，特异性引物ATHP3/ATHP4第二轮PCR扩增片段大小为370bp。 5.4 实时荧光PCR检测结果 当空白对照的Ct值≥40，供试菌株的Ct值≤36，则检测结果为阳性，否则为阴性 6结果判定 田间向日葵为害症状同5.1，向日葵病组织（向日葵病叶和种子）中病原菌的形态特征与5.2的描述 一致，可判定为向日葵白锈病菌。 条带，可判定为向日葵白锈病菌。 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，用实时荧光PCR法检测结果为： 一Ct值小于或等于36，则判定为向日葵白锈病菌； 2 GB/T 31808—2015 一Ct值大于或等于40，则判定为非向日葵白锈病菌； 一Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大 于或等于40，判定同上；如果检测Ct值仍在36～40之间，则应进行形态学方法鉴定。 7样品与原始数据保存 7.1 样品保存 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式妥善保存。如样品中发现向日葵白锈病菌，该样品 应保存半年以上，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕，保存期满后应经灭菌处理。 7.2原始数据保存 样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 7.3菌种保存 用干净剪刀将具典型症状的向日葵白锈病叶剪成1cm×1cm左右的小片，置于菌种保藏管中，经 3