ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 31805—2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31805—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈青、李彬、方志鹏、黄峰、廖富荣、陈红运、林石明 I GB/T31805—2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学、生物学和分子检测方法。 本标准适用于可能携带有豇豆重花叶病毒的植物繁殖材料（种子、植株）和产品的检疫鉴定。 2仪器设备和主要试剂 2.1仪器设备 PCR仪、定量PCR仪、灭菌锅、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系 统、微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、水平电泳槽、高速冷冻台式离心机、水浴槽、 pH计、移液器（1000μL、200μL、20μL、2μL）、96孔酶标板、研钵等；防虫温室。 2.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、DNA 聚合酶、引物和探针、琼脂，酶联检测试剂见附录B。 3检测样品的制备 3.1种子 挑取畸形种子播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株 分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子检测。 3.2植株 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法 和检测方法同3.1。双抗体夹心酶联免疫吸附测定。 4检测与鉴定 4.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加入已包被CPSMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA。每个样品平行加到 两个孔中。设阴性对照和阳性对照[健康的植物组织作阴性对照，感染了CPSMV的植物组织作阳性对 照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致」，样品提取缓冲液作空白对照，不 同的检测试剂或试剂盒按说明操作。具体操作见附录B。 4.2RT-PCR 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染CPSMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。 1 GB/T31805—2015 4.3IC-RTReal-timePCR 分别提取样品和对照的总RNA，进行IC-RTreal-timePCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感 染CPSMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。 4.4 生物学测定 样品按1：2～1：10（质量：体积）加人研磨缓冲液，在研钵中研碎。研碎后放入硅藻土（浓度为 0.5%）并与病汁液混匀，接种到鉴别寄主上。具体操作参见附录E。 5结果判断 样品经DAS-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定样品未检出豇豆 重花叶病毒。 样品经DAS-ELISA检测结果为阳性，进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测。 PCR结果为阴性，判定未检出豇豆重花叶病毒；PCR结果为阳性，可以判定为样品检出豇豆重花叶 病毒。 6结果记录与样品保存 6.1 结果记录 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和 实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据；PCR检测需有电泳结果图片及序列测定分析 结果；实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值；生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。结果记录与资 料保存期限至少1年。 6.2样品保存 经检验确定携带CPSMV的样品应在合适条件下保存以备复核，种子保存在4℃，病叶冻干保存在 一20℃或者一80℃冰箱中，做好标记和登记工作。样品保存期限至少1年。 GB/T31805—2015 附录A （资料性附录） 豇豆重花叶病毒相关资料 A.1背景资料 A.1.1豇豆重花叶病毒基本信息 学名:Cowpea severe mosaic virus 缩写：CPSMV 分类地位：虹豆花叶病毒属（Comovirus）成员。 A.1.2 2方法原理 豇豆重花叶病毒的分子生物学特性、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据。 A.2自然寄主 菜豆（Phaseolus vulgaris）、大豆（Glycine mar）绿豆（Vigna radiata）、豇豆（Vigna sinensis）、长 豇豆（Vigna sesquipcdalis），毛蔓豆（Calopogoniummucunoides），直生刀豆（Canavalia ensiformis）， 距瓣豆（Centrosemapubescens），蔽麻（Crotalariajuncea），Desmodiumcanescens，大翼豆 (Macroptilium lathyroides),四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus),Crotalaria paulinea 。 A.3病害症状 几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显疱状 突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。 大豆：在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结数减少、产量降低； 毛蔓豆：出现严重花叶和疱状突起； 距瓣豆：出现褪绿和花叶症状； 蔽麻：叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状； 绿豆：叶片出现轻花叶和坏死斑症状； 豇豆：叶片出现褪绿花叶和严重畸形。 A.4分布 美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里 南、巴西、秘鲁、墨西哥。 A.5传播途径 CPSMV可以通过机械传播，花粉、种子传播，豇豆的种传率为1o%，长豇豆（Vignasesquipcdalis） 3