ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T31801—2015 丁香疫霉菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phytophthora syringae Kleb. 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31801—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：杜洪忠、罗加凤、吴品珊、严进。 I GB/T31801—2015 丁香疫霉菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了丁香疫霉菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于针对丁香疫霉菌寄主的苗木、枝条、枝叶、果实及其夹带土壤和介质中丁香疫霉菌的 鉴定。 2仪器和用具 2.1仪器 生物显微镜，超净工作台，光照培养箱，电子天平（1/1000g），高压灭菌锅，冰箱，PCR扩增仪，荧光 PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪，高速冷冻离心机，恒温水浴锅。 2.2用具 烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养血，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研杆， 移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。 3试剂、材料和培养基 3.1试剂 β-谷笛醇，匹马霉素（pimaricin），氨苄青霉素钠盐（ampicillin），利福平钠盐（rifampicin），五氯硝基 苯（pentachloronitrobenzene)，恶霉灵（hymexazol),CaCO，琼脂糖，Tris-HCl,MgCl2，HCl,乙二胺四乙 酸四钠盐（EDTA）,NaOHNaOAc，KClTris，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），TAE，无水乙醇（etha- nol），三氯甲烷（chloroform），异丙醇（isopropanol)，异戊醇（isoamylalcohol)，SYBRGreenI核酸染料， 蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，dNTP，通用引物ITS5和ITS4，实时荧光PCR引物PS-F和PS-R及Taq- Man-MGB探针PS-Pr。 3.2材料 琼脂粉，V8汁，夏栎叶片或苹果或梨，鲜橙皮或杜鹃叶片。 3.3培养基 PDA培养基，V8培养基，V8鲜橙皮培养基，V8杜鹃叶片培养基，选择性培养基PARPH-V8。具 体配方参见附录A。 4检疫鉴定方法 4.1症状检查 检查寄主植物的根、茎、叶、果实等部位，对有枯萎、果腐、根腐、颈腐和流胶症状的植物，以及根周围 1 GB/T31801—2015 的土壤和介质取样送实验室做进一步检验。丁香疫霉菌为害症状参见附录A。 4.2寄主组织分离培养 可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min，取根、茎、叶、果实果皮的病健交界处，剪成 17℃黑暗培养。 培养4d～6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基或PDA 培养基纯化，17℃黑暗培养。 4.3土壤和介质诱集 称量土块或介质25g，碾碎放人500mL灭菌洁净烧杯中。无菌水将土样或介质润湿（无流动水）， 每份样品加灭菌蒸馏水，水面距土表4.0cm，然后加入10片左右直径8mm~10mm的新鲜夏栎 （Quercusrobur）叶片或未成熟的苹果或梨果实的小切片，切片大小以漂浮在水面为宜，Parafilm膜封口 保湿，17℃~20℃黑暗条件下放置。 4.4诱集检查和培养 诱集2d3d后，观察夏栎叶片或苹果或梨附近是否有棕色病变区，从变色的病健交界处取5mmX 5mm小块，75%乙醇消毒30s，置V8培养基或选择性培养基PARPH-V8,17℃黑暗培养 培养4d6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转入V8培养基纯化或 PDA培养基，17℃黑暗培养。 4.5孢子囊和菌丝膨大体诱发 取纯化后菌落边缘菌丝块，置于盛有10mL无菌水的培养血中，17℃～20℃黑暗条件下诱发孢子 囊和菌丝膨大体，48h后观察菌丝块周围孢子囊和菌丝膨大体产生情况。 4.6卵孢子诱发 取纯化后菌落边缘菌丝块，置于加人β-谷留醇（20mg/L）或植物油（玉米油、亚麻籽油、麦芽油）的 V8培养基中，黑暗条件下8℃～10℃低温培养4周。 如果寄主材料是柑橘属的果实，则将纯化后菌落边缘菌丝块置于V8鲜橙皮培养基或V8杜鹃叶片 培养基，10℃黑暗培养，7d后观测病菌卵孢子产生情况。 4.7DNA提取 收集分离到的病菌菌丝，采用 CTAB法提取核酸。参见附录B。 4.8实时荧光PCR检测 实时荧光PCR引物序列为PS-F：5'-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'和PS-R：5°-AGTGGGC TACTAGCTCCAGGC-3'，TaqMan-MGB 探针 PS-Pr:5'-(FAM）TGGCGACCGCTCTGA （NFQ- MGB)-3°，探针5端标记的荧光报告基团为FAM,3端标记的非荧光猝灭基团为MGB。 反应体系（25μL)：样品DNA1μL,10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgClz2μL，2.5mmol/L dNTPs2μL,10μmol/LPrimers各1μL,10μmol/L探针PH-Pr1.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.3 μL,ddH20 13.7 μL。 反应循环为94℃10min；94℃15s，56℃60s，循环40次。 2 GB/T31801—2015 4.9ITS基因检测和序列比对分析 可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法。 利用真菌通用引物ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4（5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3'）进行扩增 反应体系（25uL）：样品DNA1uL，10XPCR缓冲液2.5uL，25mmol/LMgCl2uL，2.5mmol/I dNTPs2μL,10μmol/LPrimers各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL，ddH,O15.2μL。同时设 置空白对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。 PCR反应条件为：94℃4min；95℃1min,56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min；4℃ 保存。 PCR产物的检测，在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreenI核酸染料）凝胶电泳， 5V/cm，凝胶成像仪分析结果。如有900bp左右大小的条带出现，将扩增产物进行序列测定， 将测序后的序列与NCBI网站GenBank中公开发表的Phytophthorasyringae的序列进行 BLAST分析。 5鉴定特征 5.1生物学特征 5.1.1菌落特征 丁香疫霉菌在V8培养基和PDA培养基上生长较为缓慢。在V8培养基上菌落稀疏，呈放射状、星 状或菊花花瓣状，菌落的花瓣区域较尖、窄，菌落形态图参见附录C。在PDA上菌落边缘约呈花瓣状， 乳白色，菌丝体浓密，菌落中央区域皱孔状 5.1.2病菌形态 无性生殖阶段孢子囊梗呈单歧聚伞花序状分枝。孢子囊具有不完全的乳头状突起，形状为卵形或 倒梨形，不易脱落，单独生在顶端或整个集结在一个孢子囊梗上。孢子囊大小为（21.0μm75.0μm）× （11.0μm~42.0μm），平均47.0μm×30.0μm，长宽比在1.1：1至2.1：1之间。孢子囊不易脱落，不 增殖，但可直接在附近萌发产生一个新的孢子囊。孢子囊具有平的盖，裂开释放游动孢子，游动孢子卵 形，侧生二根鞭毛。 病菌易产生菌丝膨大体，念珠状，卵形、球形或不规则形，常萌发产生较细的菌丝，菌丝膨大体中的 内含物最终会逐渐释放殆尽，成为空壳。 病菌为同宗配合，藏卵器球形，直径23.4um～40.0μm；卵孢子充满藏卵器，通常为圆形，黄色，大 小为20.1μm~34.7μm；雄器单个或数个，平滑，多侧生。 丁香疫霉菌的形态图参见附录C。 5.1.3与近似种的形态区别 与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌（Phytophthora hibernalis）。主要区别为丁香疫 霉菌落的花瓣区域较尖、窄，孢子囊不易脱落，具有菌丝膨大体，雄器多侧生；冬生疫霉菌落的花瓣区域 较宽，孢子囊易脱落，无菌丝膨大体，雄器多围生，参见附录D。 5.2实时荧光PCR检测 若阴性对照及空白对照的Ct值≥40，供试菌Ct值≤36，可判定为阳性。 3