ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T31800—2015 李痘病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Plum pox virus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31800—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈先锋、张慧丽、陈定虎、张吉红、徐瑛、郭立新、闻伟刚、杨红霞、杜洪忠、吴品珊。 I GB/T31800—2015 李痘病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了李痘病毒的免疫学和分子生物学检疫鉴定方法。 本标准适用于植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子、花和果实中李痘病毒的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 3仪器设备和主要试剂 3.1 仪器设备 普通PCR仪、实时荧光PCR仪、酶标仪、电子天平（1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水 浴锅、台式高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡 器。可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 3.2 2主要试剂 除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、β-巯基乙醇、RNA反转录酶 TaqDNA聚合酶、SYBRgreenI、DNA相对分子质量标准物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。双抗体酶 联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)检测试剂配制方法见附录B中B.1。 4检疫鉴定方法 4.1症状检查 仔细检查植株的叶片及花、果实、果核是否有褪色、环斑、畸形等可疑症状，如果出现了典型症状（参 见附录A），可采集表现症状的花、叶片或果实进行后续检测。 4.2 双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA） DAS-ELISA具体操作步骤见附录B。 4.3普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录C。 1 GB/T31800—2015 4.4 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录D。 4.5 免疫电子显微镜观察 按SN/T1840执行。 4.6 6株系鉴定 在检出李痘病毒时，必要时可对其进行株系鉴定，株系鉴定的具体操作步骤见附录E。 5 结果判定 采用DAS-ELISA进行初筛，测定结果为阴性，判定未检出李痘病毒；测定结果为阳性，用普通 RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法进行验证，当验证结果也为阳性时，则判定检出李痘病毒。若需 进一步鉴定该病毒，可采用免疫电子显微镜观察或PCR产物序列测定等进行复验。 6 样品保存与结果记录 6.1 样品保存 冰箱中，妥善保存6个月，以备复核 6.2 结果记录 需要保存的记录包括：样品的种类、自然状态、来源、为害症状及为害程度（无症状也要说明），诊断 时使用的方法（包括质控物质，以及每种方法获得的结果），酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的 责人和鉴定人的签字等。 N GB/T31800—2015 附录A （资料性附录） 李痘病毒相关信息 A.1李痘病毒基本信息 中文名：李痘病毒 学名:Plum por virus 异名：Sharkavirus 缩写：PPV 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyuiridae），马铃薯Y病毒属（Potyuirus）。 A.2方法原理 李痘病毒为害症状、血清学特性和基因组特征是制定本标准的主要依据。根据李痘病毒免疫原性 强，可以制备病毒抗血清和外壳蛋白基因保守性强，可以设计特异性引物和探针。采用双抗体夹心酶联 免疫吸附反应和逆转录-聚合酶链式反应以及序列测定作为该病毒的检疫鉴定依据。 A.3寄主范围 PPV能侵染木本科和草本科寄主，自然条件下，PPV很容易侵染李属植物：杏（Prunus armeniaca）、桃（P.persica）、油桃（P.persica var.nectarina）、欧洲李（P.domestica）、李（P.salicina）乌荆 子李（P.insititia）、樱桃李（P.cerasifera）、麦李（P.glandulosa）、甜樱桃（P.avium）、欧洲酸樱桃 （P.cerasus）。野生的李属寄主：扁桃（P.amygdalus）、杏（P，americana）、西沙樱桃（P.bessey）、马哈 利樱桃（P，mahaleb）、梅（P，mume）、矮樱桃（P.pumila）、郝图兰李（P.hortulana）、山桃（P.davi dana）、毛樱桃（P.tomentosa）、紫杏（P.nigra）、滨梅（P.maritime）、桂樱（P.laurocerasus）。 A,4病害症状 PPV在植株的叶片、花瓣、果实和果核都可能引起症状。 叶片：叶上症状特别清晰，出现带状或环状褪绿斑，明脉甚至畸形，见图A,1a、b、c。 花瓣：引起花瓣褪色，见图A.1d。 果实：果皮上出现褪绿或环斑，见图A.1e、f、g。果实受害后有时会变形，呈不规则状并在其褪色 环内形成褐色或坏死区域，果实内部变褐见图A.1i。 果核：染病的果核上产生浅色的环斑，见图A.1h。 3