ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T31792—2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Diaporthe helianthi Muntanola-Cvetkovic Mihalicevic et Petrov 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31792—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国合格评定国家认可中心、中华人民共和国新疆出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴品珊、杜洪忠、蔡露敏、张祥林、严进 I GB/T31792—2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了向日葵茎溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于向日葵植株和种子中向日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定。 2仪器和用具 2.1仪器 体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、冰箱、PCR 扩增仪、荧光PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。 2.2用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解部刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杆、 移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、样品筛（10目，g1.7mm）。 3试剂和培养基 3.1试剂 葡萄糖，链霉素，乳酸，琼脂，1.0%次氯酸钠（NaCIO），液氮，Tris-HCl,MgCl2，HCl,EDTA，NaOH， NaOAc，KCl,Tris，CTAB，TAE，无水乙醇（Ethanol)，三氯甲烷（Chloroform)，异丙醇（Isopropanol)，异 戊醇（Isoamylalcohol),SYBRGreenI核酸染料，蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，dNTP，通用引物ITS5 和ITS4，实时荧光PCR特异性引物DH-F、DH-R及探针DH-Pr。 3.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），链霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基（SPDA）。具体配方参见附 录A。 4检疫鉴定方法 4.1症状检查 采集田间疑似症状的茎杆、病叶或葵盘，剪取病健交界处的组织材料备用。病害典型的症状是茎杆 和叶柄处有淡褐色溃疡病斑，详见附录A病害症状描述， 在种子中挑选干癌、变色、皱缩、残缺或霉变的种子，同时挑选其中夹带的向日葵残体，如叶柄、茎 杆、花盘碎片等。 4.2 2分离培养 将有疑似症状的叶片、叶柄、茎杆、花盘碎片等样品在病健交界处剪取5mm～10mm的小块，用 1 GB/T31792—2015 1%次氯酸钠表面消毒5min~10min，灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干后，置于含链霉素的 SPDA培养基平皿中，25℃、8h光照/16h黑暗条件下培养，3d～5d后开始观察 将种子样品用1%次氯酸钠表面消毒5min10min，灭菌水冲洗3次，保持无菌状态，在室温25℃ 下放置24h，再在一20℃下冷冻24h，然后转至含链霉素的SPDA培养基平血中，25℃、8h光照/16h 黑暗条件下培养，3d～5d后开始观察。 有种衣剂的种子，先将种衣剂洗掉（参见附录A），再进行上述操作。 4.3生物学鉴定 如在SPDA培养基上观察到真菌菌落，转接到PDA培养基平皿上纯化培养，5d～7d后开始观察 记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子和分生抱子器的形态和大小。 4.4分子生物学检测 4.4.1DNA提取 收集分离到的真菌菌丝，采用CTAB方法提取DNA（参见附录B）。 4.4.2实时荧光PCR检测 实时荧光PCR引物序列为DH-F：5'-CGCTTATCTCTTACACCAAAACCCT-3'，DH-R： 5'-GCAGCTATTGAAACAGCTCATCTG-3',TaqMan 探针DH-Pr:5'-FAM-ATGCACCCACCGCA CTCCTGC-BHQ-1-3。探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1。 反应体系（25μL）：样品DNA1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl²2μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,1oμmol/LPrimers各1μL,1oμmol/L探针DH-Pr1.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.3uL，ddH2O13.7uL。以无菌双蒸水作空白对照，阳性对照以向日葵茎溃疡病菌DNA为模板，阴性 对照以向日葵上其他真菌DNA为模板。 反应循环为：94℃10min；94℃15s、56℃60s，40个循环。 4.4.3ITS基因检测和序列比对 可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法。 可利用真菌通用引物ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS4（5'-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3')进行扩增。 25μL反应体系（25μL）：样品DNA1μL（1ng~50ng），10XPCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl,2μL,2.5mmol/LdNTPs2μL,10μmol/LPrimers各0.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.2μLddHzO16.3μL。同时设置阴性对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。 PCR反应条件为:94℃4min;95℃1min、56℃30s、72℃45s，35个循环；72℃10min;4℃ 保存。 PCR产物的检测在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreen1核酸染料）凝胶电泳， 5V/cm，凝胶成像仪分析结果。如有500bp左右大小的条带出现，将扩增产物进行序列测定。 将测序后的序列与NCBI网站GenBank中公开发表的Diaporthehelianthi的序列进行BLAST 分析。 5鉴定特征 5.1培养性状 向日葵茎溃疡病菌在PDA培养基上生长，菌落初期为白色，菌丝体较密集，两周后渐渐变为褐色 2 GB/T31792—2015 至深褐色，其间形成暗褐色分生孢子器，菌落形态图参见附录C。 5.2病菌形态 向日葵茎溃疡病菌的菌丝分隔，分生孢子器聚生或散生，浅褐色、褐色至黑色，球形或扁球形，直径 120μm～450μm，含有α和β两种类型的分生孢子。α分生孢子无色、单胞，纺锤形或椭圆形，常有 为钩状，无油球，大小（16μm~42μm）×（0.5μm6.9μm）。 病菌在植物残体上形成有性器官。子囊壳直径350μm～450μm，有喙状突起长350μm~ 600um；子囊无色，大小（44μm67μm）×（7.5μm~12.5um），含8个子囊孢子；子囊孢子双胞、无色、 椭圆形，大小(12.5μm~19μm）×（2.8μm~7.5μm）。 向日葵茎溃疡病菌的α型分生孢子，β型分生孢子的形态图参见附录C。 5.3实时荧光PCR检测 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下： Ct值小于或等于36，判定阳性； 一Ct值大于或等于40，判定阴性； 一Ct值在3640之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后如Ct值小于或等于36，或者Ct值大 于或等于40，判定同上。 5.4ITS序列比对 经BLAST分析，PCR扩增到的ITS基因序列与NCBI网站GenBank中登录号为FJ841862.1的 Diaporthehelianthi的序列同源性为99%～10o%，则判定为阳性。 6结果判定 病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致，且实时荧光PCR检测结果呈阳性，或ITS序 列比对99%～100%同源，可判定为向日葵茎溃疡病菌。5zc 7样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出向日葵茎溃疡病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以 备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 8菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为向日葵茎溃疡病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基 斜面上，20℃培养5d，4℃～8℃黑暗条件下保存，定期（60d）转接，至少保存6个月。必要时用病菌 的分生孢子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭菌灭活处理。 9结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。 3