ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31789—2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phytophthora hibernalis Carne 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31789—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：杜洪忠、吴品珊、王宏毅、严进、张秋娥。 I GB/T31789—2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了冬生疫霉菌的检疫鉴定方法， 本标准适用于针对冬生疫霉菌寄主的苗木、枝条、枝叶、果实以及夹带土壤和介质中冬生疫霉菌的 鉴定。 2仪器和用具 2.1仪器 生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、荧光 PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。 2.2用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解部刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杆、 移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐。 3试剂、材料和培养基 3.1试剂 匹马霉素（pimaricin），氨青霉素钠盐（ampicillin），利福平钠盐（rifampicin），五氯硝基苯（penta chloronitrobenzene），碳酸钙（CaCO，），β-谷笛醇（β-sitosterol），色氨酸（tryptophan），硫氨（thiamine）， 氯化钙(CaCl²：H,O),次氯酸钠(NaCIO)。 （十六烷基三甲基溴化铵），TAE，无水乙醇（Ethanol），三氯甲烷（Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异 戊醇（Isoamylalcohol)，SYBRGreenI核酸染料，蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，dNTPs,DNA相对分子 质量标准物，PCR引物PHIB1和PHIB2，实时荧光PCR引物PH-F和PH-R及TaqMan-MGB探针 PH-Pr。 3.2材料 琼脂粉、V8汁、雪松松针（Cedrusdeodara）、柑橘叶片（Citrusspp.）、胡萝卜、玉米油。 3.3培养基 V8培养基、胡萝卜丝培养基CPA、选择性培养基PARP-V8和卵孢子培养基，具体配方参见附 录B。 4检疫鉴定方法 4.1症状检查 重点观察柑橘果实是否有褐色病变，叶和小枝是否枯萎；杜鹃属植物，观察叶片是否有深褐色病斑， 1 GB/T31789—2015 或整个叶片和叶柄变褐；参见附录A。玫瑰受害症状为叶部和小枝枯萎，茎基部有深紫色到黑色病斑； 其他寄主上为根部腐烂或溃疡。 4.2分离培养和诱集 4.2.1寄主组织分离培养 可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min，在病健交界处或变色部位切取边长为5mm× 5mm的样品，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性培养基PARP-V8上，或用0.5%次氯酸钠消毒2min～ 培养皿16℃～20℃黑暗培养4d～6d，如有真菌菌落出现，转到V8培养基上纯化，16℃～20℃ 黑暗培养。 4.2.2土壤和介质诱集 称取25g土壤或介质，碾碎去杂放入灭菌烧杯中，加入无菌水将土壤或介质润湿（无游离水），保 鲜膜封口，置于16℃~20℃黑暗放置。 3d～5d后在烧杯中加入灭菌水，使水层高4.0cm。取雪松松针或柑橘叶片，无菌水清洗后漂放在 水面或浸在水中，16℃～20℃黑暗放置。 2d～3d后开始检查，取有失绿或变色的松针或叶片，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性 培养基PARP-V8或胡萝卜丝培养基上，16℃20℃黑暗培养。如有真菌菌落出现，转到V8培养基 上纯化，16℃~20℃黑暗培养。 4.2.3孢子囊培养 取纯化后菌落边缘菌丝块，置于盛有10mL无菌水的培养皿中，16℃～20℃黑暗条件下诱发孢子 囊，48h后观察菌丝块周围孢子囊产生情况。 4.2.4卵孢子培养 将分离菌转至卵孢子培养基上，7℃～8℃培养1周～2周，观察是否有卵孢子形成。 4.3分子生物学检测 4.3.1DNA提取 收集分离到的真菌菌丝，采用CTAB法提取核酸。参见附录C。 4.3.2PCR检测 特异性引物PHIB1和PHIB2的序列分别为5-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'和5'-CT TCCACAACCAATTCCATTATGC-3'。 反应体系（25uL)：样品DNA1μL，10×PCR缓冲液2.5μL25mmol/LMgClz2uL，2.5mmol/L 在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreenI核酸染料）凝胶电泳，5V/cm，凝胶成 像仪分析结果。 4.3.3实时荧光PCR检测 可以选择荧光PCR检测。 2 GB/T31789—2015 实时荧光PCR引物序列为PH-F：5'-CGACTTGCCACCGGGA-3'和PH-R：5'-AACGGTACTT CTCTTTGCTCGAA-3',TaqMan-MGB探针PH-Pr:5'-(FAM)TTCCACAACCAATTCCAT（NFQ MGB)-3°，探针5端标记的荧光报告基团为FAM,3端标记的非荧光猝灭基团为MGB。 反应体系（25μL)：样品DNA1μL,10XPCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl²2μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,1oμmol/L引物各1μL,10μmol/L探针PH-Pr1.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.5 μL,ddH2013.5μL. 反应循环为94℃10min；94℃15s，56℃60s，循环40次。 5鉴定特征 5.1菌落特征 冬生疫霉菌在V8培养基上生长速度较慢（4mm/d～8mm/d），菌落白色，平贴至中度的蓬松，呈 玫瑰花瓣状，花瓣状区域较宽且圆，V8培养基淡橘黄色。参见附录D。 5.2病菌形态 冬生疫霉菌的孢子囊长卵圆形或椭圆形，易脱落，顶部具有不完全的乳头状突起，通常基部锥形、顶 部近半乳突处最宽。 73 μm。 孢囊梗不分枝或窄的长分枝，或形成不规则合轴式长侧枝。孢子囊低温萌发释放游动孢子。病菌 不产生厚垣孢子，一般无菌丝膨大体。 该菌为同宗配合，雄器多围生，偶侧生，平均10μm×15μm；卵孢子黄橙色，满器，大小为22μm～ 孢子囊、雄器和卵孢子形态图参见附录D。 5.3与近似种的形态区别 冬生疫霉菌与丁香疫霉菌（Phytophthorasyringae）在形态上很相似，主要区别为冬生疫霉菌落的 花瓣区域较宽，抱子囊易脱落，雄器多围生；丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖、窄，孢子囊不脱落，雄器多侧 生，有菌丝膨大体。参见附录E。 5.4PCR特异性产物 引物PHIB1和PHIB2的特异性PCR扩增目的片段为407bp。 5.5实时荧光PCR检测 若阴性对照及空白对照的Ct值≥40，供试菌Ct值≤36，可判定为阳性。 6结果判定 病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致，且PCR检测结果或实时荧光PCR检测结果 呈阳性，可判定为冬生疫霉菌。 3