ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 31787—2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法 Molecular detection of Carnation ringspot virus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31787—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫 局、上海市标准化研究院、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨翠云、于翠、魏亚东、杨瑞钰、张卫东、郭京泽、胡培龙、崔学慧 I GB/T31787—2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法 1范围 方法。 本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3仪器设备、用具和试剂 3.1 仪器设备 PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10O000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系 统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器 3.2用具 可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）及相应的无RNase吸头、无RNase离 心管、PCR管和研钵等。 3.3试剂 RT-PCR试剂(见附录B),IC-RT-PCR试剂（见附录C)。 4症状观察及抽样 4.1号 症状观察 现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，CRSV为害症状描述参见附录A。 4.2抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送 实验室进行病毒检测鉴定。 5病毒检测 5.1RT-PCR方法 将送检植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA，然后 1 GB/T317872015 反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录B。 5.2免疫捕获RT-PCR方法（IC-RT-PCR） 将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨，并按重量和病毒抽提缓冲液 1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品。 用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加人制备的待测样品，进行免疫捕获 然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录C。 5.3实时荧光RT-PCR方法 采用5.1或者5.2方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录D。 6防污染措施 香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定。制样用的研钵经 过洗涤液清洗后，160℃干热处理2h。 7结果判定 样品经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时，证明样品不携带 香石竹环斑病毒。 样品经RT-PCR或IC-RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测 的香石竹环斑病毒一致，可判定样品携带香石竹环斑病毒。 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，也可判定样品携带香石竹环斑病毒。 8样品保存和结果记录 8.1 样品保存 经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品，应妥善保存在一80℃冰箱中。并做好登记和标记工作。 保存期满后，需经灭活处理。 8.2结果记录 记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RT 与Ct值。 GB/T 31787—2015 附录A （资料性附录） 香石竹环斑病毒背景资料 A.1背景资料 A.1.1香石竹环斑病毒基本信息 中文名：香石竹环斑病毒。 学名:Carnation ringspot wirus。 缩写:CRSV。 分类地位：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae），香石竹环斑病毒属（Dianthovirus）。 传播途径：该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土 壤污染和农事操作等引起病毒传播。尚未见种传报道。 A.1.2方法原理 用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA，或直接从待测样品材料 中提取植物总RNA，然后在逆转录酶的作用下合成cDNA，以cDNA为模板再通过普通PCR或实时荧 光PCR进行检测。分析PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酸成分。 A.2寄主范围 香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广，在自然条件下，CRSV主要侵染香石竹，还可侵染 李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草，如：繁缕。 在实验条件下，CRSV可侵染25科共133种植物，可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物，非系统 侵染的寄主范围更广。 A.3为害症状 CRSV侵染香石竹引起叶片环斑、斑驳，导致叶和花的扭曲及畸变，严重可致叶尖坏死。当CRSV与 香石竹斑驳病毒（Carnationmottlevirus）共同侵染时，症状加重。CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现。 CRSV接种如下几种鉴别寄主可产生相应的症状，可用来作为该病毒的鉴定方法之一。 苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）和昆诺藜（C.quinoa）：接种叶出现局部褪绿或坏死斑，通常 无系统症状。 三生烟（Nicotianatabacumvar.SamsunNN）：接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑，后期病斑连成 一片。 豇豆（Vignaunguiculatassp.Sinensis）：接种叶产生局部坏死斑，接着系统感染叶产生斑驳、坏死 斑、叶片卷曲或脉缩。 美国石竹（Diathusbarbatus）：接种叶产生环状病斑，接着为系统褪绿及坏死斑。 千日红（Gomphrenaglobosa）：接种叶产生局部坏死环斑，接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形。 菜豆（Phaseolusulgaris）：接种叶产生局部坏死斑，接着叶变白、坏死，产生不规则系统斑，坏死叶 3 SG