ICS 07.060 A45 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 30737—2014 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法 Determination of marine photosynthetic picoplankton- Flow cytometry 2014-06-09发布 2014-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30737—2014 目 次 前言 范围 1 规范性引用文件 2 3 术语和定义 方法原理 主要仪器设备 试剂 6 样品采集与处理 测定步骤 结果分析与计算 附录A（规范性附录）海洋微微型光合浮游生物测定流式细胞测定法采样和测定结果记录表格式7 参考文献 GB/T30737—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家海洋局提出。 本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口。 本标准起草单位：国家海洋局南海环境监测中心、厦门大学、国家海洋局第二海洋研究所、华东师范 大学、中国科学院南海海洋研究所。 本标准主要起草人：朱艾嘉、焦念志、黄楚光、骆庭伟、邓鸿、乐凤凤、邱大俊、李海涛、杨振雄、林端、 方宏达、许战洲、蔡伟叙、曲念东。 GB/T30737—2014 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法 1范围 胞测定法。 本标准适用于海洋微微型光合浮游生物中上述3个主要类群细胞数量的流式细胞测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T12763.6一2007海洋调查规范第6部分：海洋生物调查 3术语和定义 GB/T12763.6一2007界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 浮游生物plankton 缺乏发达的运动器官，没有或仅有微弱的运动能力，悬浮在水层中，常随水流移动的生物。 注：改写GB/T12763.6—2007，定义3.9。 3.2 微微型浮游生物picoplankton 粒径范围在0.2μm～2μm的浮游生物 注1：微微型浮游生物不是一个严格的生物学概念，而是一个生态学概念。 注2：改写GB/T12763.6—2007，定义3.9。 3.3 微微型光合浮游生物photosyntheticpicoplankton 能进行光合作用的微微型浮游生物 注：微微型光合浮游生物又包括自养和异养两种类型，以自养型的占绝对优势。自养型的微微型光合浮游生物由 三个主要类群组成：原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类。异养型的微微型光合浮游生物主要为不产氧光合细 菌(anoxygenic phototrophic bacteria,APB)。 3.4 原绿球藻 Prochlorococcus spp.;Pro. 基叶绿素（DiVinyl-Chlorophyll,DVChl)。 3.5 聚球藻Synechococcus spp.;Syn. 蓝细菌中的一属，为原核生物，粒径一般为1μm左右，除了含有叶绿素a（Chlorophylla）外，其主 1 GB/T30737—2014 要特征色素为藻胆蛋白（phycobiliprotein，PBP），包括藻红蛋白（phycoerythrin，PE）和藻蓝蛋白（phyco- cyanin,PC)。 3.6 微微型真核藻类picoeukaryotes;Euk， 素a。 4方法原理 本方法是一种在单细胞水平上对微微型光合浮游生物细胞物理化学和生物化学性质进行快速测定 的方法。含有荧光物质的微微型光合浮游生物细胞在检测区受激光照射后，产生前向散射光、侧向散射 光和荧光。前向散射光信号表征细胞的天小和形状，侧向散射光信号表征细胞质的颗粒性，荧光信号表 征细胞的荧光物质含量。根据原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类上述信号的不同进行区分和计数。 STIG 5主要仪器设备 主要仪器设备如下： a）流式细胞仪（配备488nm激光器）； b) 液氮罐； c）走 超低温冰箱（-80℃）； P 漩涡振荡器。 6试剂 6.1固定剂 样品可采用多聚甲醛溶液（固定终浓度为1%）或戊二醛溶液（固定终浓度为0.1%）进行固定，也可 同时加入多聚甲醛溶液和戊二醛溶液进行固定（固定终浓度分别为1%和0.05%）。多聚甲醛溶液和戊 二醛溶液获得方法如下： 醛溶液配置方法是：在通风橱中称取10g多聚甲醛粉未放入70mL煮沸的蒸馏水中，连续搅 拌至少2h（可使用恒温磁力搅拌器）；加入少量氢氧化钠（NaOH）溶液（0.1mol/L）直至溶液 澄清：加入10mL10%的磷酸盐缓冲液（PBS），调节到pH7.5；定容至100mL；用孔径为 存。未冻结的多聚甲醛溶液（4℃保存）使用不宜超过1周。 b）戊二醛溶液：市售电子显微镜用25%或50%戊二醛溶液。 注：上述固定终浓度均为体积百分比， 6.2鞘液 鞘液宜使用经孔径0.2μm滤膜过滤的现场海水，也可使用超纯水。 6.3标准荧光小球（beads）悬浮工作液 用超纯水稀释直径1um的标准黄绿荧光小球悬浮液至浓度约为105个/uL的工作液 2