ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25879—2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法 Determination of lysozyme in chicken egg white- Spectrophotometry 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25879—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：扬州大学动物科学与技术学院 本标准主要起草人：王金玉、谢恺舟、戴国俊、侯启瑞、刘大林 1 GB/T25879—2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法。 本标准适用于鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 蛋清egg white 位于鸡蛋蛋壳内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质。 3.2 每lysozyme 溶菌酶 一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶。 4鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的测定 4.1原理 溶菌酶在281nm波长处有最大吸收峰。溶菌酶标准品用每升溶液含9g氯化钠的溶液溶解并稀 释成不同梯度浓度，在281nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程。试样经过 处理，按溶菌酶标准品测定方法，测定试样中的吸光度，根据其吸光度值由标准曲线回归方程计算试样 中溶菌酶含量。 4.2仪器 4.2.1紫外-可见分光光度计（波长范围190nm~900nm，波长确定性土0.3nm，波长重复精度土0.1nm）。 4.2.2电子分析天平（感量0.1mg、1mg）。 4.2.3离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管）。 4.3试剂与材料 4.3.1溶菌酶标准品，优级纯，活力在20000U/mg左右 4.3.2氯化钠，分析纯。 4.3.3蒸馏水，按GB/T6682执行 4.3.4医用脱脂纱布。 4.4试剂配制 4.4.10.9%氯化钠溶液：称取氯化钠（4.3.2)0.9g，溶解于蒸馏水中，定容至100mL。 1 GB/T25879—2010 4.4.2溶菌酶标准工作液：称取溶菌酶标准品（4.3.1)0.500g，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1)溶解定容 4.5分析步骤 4.5.1标准曲线的绘制 分别吸取溶菌酶标准工作液（4.4.2)1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于25mL容量瓶中，以0.9% 氯化钠溶液（4.4.1）稀释至刻度，混匀。用10mm石英比色皿比色，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1）为参 度为纵坐标绘制标准曲线，并求出标准曲线回归方程。 4.5.2试样测定 起泡沫。吸取5mL蛋清的氯化钠溶液，1310g离心5min，取上清液，按照绘制标准曲线的操作步骤 （4.5.1），在波长281nm处测定试样溶液的吸光度。平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线 回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度。 4.6结果的计算与表述 根据试样溶液吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度c。鸡蛋蛋清中溶菌 酶的含量按式(1)计算： ....(1) 式中： X一鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量，单位为微克每毫升（μg/mL)； c——试样溶液中溶菌酶的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； V——试样溶液定容的体积，单位为毫升（mL）； Vi-试样的体积，单位为毫升（mL）。 4.7精密度、准确度、灵敏度 4.7.1精密度 本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV≤3%，批间变异系数CV5% 4.7.2准确度 鸡蛋蛋清溶液中添加溶菌酶标准品浓度在20μg/mL~60μg/mL范围内，回收率≥95%。 4.7.3灵敏度 本方法检测鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶含量的最低检测限为0.3μg/mL。 5鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定 5.1原理 溶菌酶通过溶解G+菌的细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低。酶的活力表示 法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶的活力。 5.2仪器 5.2.2电子分析天平（感量0.1mg、1mg）。 5.2.3摇床（控温范围0℃～100℃，转速振幅：0r/min300r/min）。 5.2.4pH计（精密度±0.01)。 5.2.5离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管）。 2 SAC GB/T25879—2010 5.2.6高压灭菌锅。 5.2.7超低温冰箱。 5.3试剂与材料 5.3.1氯化钠，分析纯。 5.3.2甘油（丙三醇），分析纯。 5.3.3磷酸氢二钠，分析纯。 5.3.4磷酸二氢钠，分析纯。 5.3.5牛肉膏，生化试剂。 5.3.6蛋白陈，生化试剂。 5.3.7 酵母提取物，生化试剂。 5.3.8琼脂，生化试剂。 5.3.9溶壁微球菌（MicrococcuslysodeikticusFleming）。 5.4试剂配制与培养基制备 5.4.10.9%氯化钠溶液：称取氯化钠0.9g，溶解于蒸馏水中，定容至100mL.121℃高压灭菌 30 min。 30 min。 5.4.30.2mol/LpH6.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO·12H2O)71.63g，用蒸馏水溶 解定容至1000mL；称取磷酸二氢钠（NaH,PO4·2H,O)33.00g，蒸馏水溶解并定容至1000mL。取 NazHPO,溶液18.5mL与NaH,PO,溶液81.5mL混合，混匀即可。 5.4.4固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白陈1.0g、氯化钠0.5g溶解于100mL水中，各组分溶解后，加 入琼脂2.0g，持续搅拌至琼脂完全溶解，用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4，并用水定容至 100mL，分装在试管里，每管液量为15mL～20mL，加棉花塞，121℃高压灭菌30min后，倒人培养皿 中加盖，冷却至室温。 5.4.5液体B培养基：蛋白陈1.0g、酵母提取物0.5g、氯化钠1.0g溶解于100mL水中，用1mol/ 氢氧化钠调整pH至7.2～7.4，分装在试管里，121℃高压蒸汽灭菌30min。 5.5分析步骤 5.5.1菌液的制备 将溶壁微球菌（5.3.9)先接种于灭菌的固体培养基（5.4.4)中活化和扩大培养，再接种于灭菌的液 体LB培养基（5.4.5)中，37℃摇床培养至菌体增殖，培养9h~10h，将培养液1310g离心10min，收 集沉淀的菌体。该菌体加入3倍体积灭菌的0.9%氯化钠溶液（5.4.1)悬浮，1310g离心10min，收集 沉淀的菌体，重复4次～5次。再用20%甘油溶液（5.4.2）将菌体制成黏稠状，置于一60℃保存，半年 内使用。 使用前，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）溶解溶壁微球菌，调至OD450吸光度值范围在1.2～1.4,2℃~ 8℃放置。 5.5.2鸡蛋蛋清溶液的制备 鸡蛋蛋清用4层纱布过滤。取过滤试样1mL，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）定容至100mL，1310g离 心5min除去不溶物。 5.5.3试样测定 按4.5的方法，在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度，并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c。 鸡蛋蛋清溶液、菌液于25℃水浴中保温，在450nm波长处测定酶活力.试样测定反应体系见表1。