ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T258762010 牛早期胚胎性别的鉴定 巢式 PCR 法 Method of nested PCR for sex identification of early cattle embryo 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 25876—2010 前言 本标准的附录B为规范性附录，附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、刘辉、刘文举、胡修忠。 1 GB/T 25876—2010 牛早期胚胎性别的鉴定 巢式 PCR 法 1 范围 本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的巢式PCR方法。 本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 巢式 PCR nestedpolymerasechainreaction 利用两套PCR引物（巢式PCR引物对）进行两轮PCR扩增反应，在第一轮扩增中，外引物用以产 生扩增产物，此产物在内引物的存在下，作为DNA模板，进行第二轮扩增。 3. 2 SRY基因 SRY gene 哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。 3.3 HBB gene HBB基因 β珠蛋白基因，位于常染色体上。 4原理 利用巢式PCR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的SRY基因片段进行扩增，以 HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PCR扩增产物，根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。 5引物 SRY1 5'CTACTCCCCAACCGTCAGAAC 3' 5'AGCCCAAACCCATCAACCTA3 SRY2 5'CCAGGGAACTGCTTGGGTA 3' 5'TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA 3 HBB 5'TATCCCACTTACAAGGCAGGTT 3' 1 GB/T25876—2010 5'GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA 3 6试剂和仪器 6.1主要试剂 水应符合GB/T6682中灭菌双蒸水的要求。 TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液、1oobp梯度DNA标记物 TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、溴化乙锭等。具体制备方法参见附录A。 6.2主要仪器 冷冻离心机、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微 量移液器。 7检测方法 7.1试样的制备与保存 从待检胚胎中分离4个（或4个以上）细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放人0.5mLPCR管中，加 上清液保存于4℃冰箱中备用。 7.2SRY基因片段PCR扩增 第一次扩增体系为20μL:0.8mmol/L的dNTP、2U的TaqDNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基 因外引物SRY1和内参照引物HBB、10XPCR缓冲液、2.5mmol/L的氯化镁，加适量双蒸水；反应程 10 min,4℃保温2min~10 min。 取第一次PCR扩增产物8μuL，作为第二次扩增模板，同时加人10XPCR缓冲液、2.5mmol/L的 氯化镁、0.8mmol/L的dNTP1.6μL，2U的TaqDNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基因内引物 SRY2和内参照引物HBB、适量的双蒸水至20μL；反应程序为95℃预变性5min，94℃变性30s， 7.3结果判定 取5μLPCR扩增产物，1.0%~1.5%琼脂糖凝胶电泳（3V/cm~5V/cm，电泳20min~30min）， 溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B.1。 电泳图谱中出现558bp（HBB扩增产物）和219bp（SRY扩增产物）条带，判定为雄性胚胎；电泳图 谱中只出现558bp条带，判定为雌性胚胎。 2 GB/T25876—2010 附 录 A （资料性附录） 试剂和材料 表A.1 试剂和材料 试剂 配方 TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0),1 mmol/L EDTA(pH 8. 0) 10XPCR缓冲液 200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾，100mmol/L硫酸铵，15mmol/L氯化镁 242.28gTris碱，57.1mL冰乙酸100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0)，加双蒸水定容至 琼脂糖电泳缓冲液 1000mL，使用时50倍稀释 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝（质量浓度），40%蔗糖（质量浓度）。 溴化乙锭 100mL双蒸水中加人0.1g漠化乙锭，搅拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶，锡箔包裹、备用