ICS 59.140.30 Y46 中华人民共和国国家标准 GB/T 38421—2019 毛皮 源性成分检测 实时荧光定性 聚合酶链式反应（PCR)检测方法 FurDetection of animal derived materialQualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods 2020-07-01实施 2019-12-31发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38421—2019 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国皮革工业标准化技术委员会（SAC/TC252）归口。 本标准起草单位：广州检验检测认证集团有限公司、国家皮革质量监督检验中心（浙江）、深圳华大 基因科技服务有限公司、浙江方圆检测集团股份有限公司、中国皮革制鞋研究院有限公司、陕西科技大 学、中国计量大学、东莞市惟思德科技发展有限公司。 本标准主要起草人：覃芳芳、黄新霞、孙海陆、陈宗良、王学川、冯爱明、张弛、孙霞、赵洋、章文福。 GB/T38421—2019 毛皮源性成分检测 实时荧光定性 聚合酶链式反应（PCR）检测方法 1范围 本标准规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于八种天然毛皮（水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊）的源性成分定性检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T21102—2007动物源性饲料中免源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法 GB/T25165—2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光聚合酶链式反应 real-time polymerase chain reaction 在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，实时监控整个PCR进程，并通过扩 增曲线对未知模板进行定性分析的方法。 注：改写GB/T19495.4—2018，定义3.1.2。 SAC 3.1.2 Ct 值 I cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 [GB/T19495.4—2018,定义3.1.5] 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） DTT：二硫苏糖醇（dithiothreitol） dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) FAM:6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein） NazEDTA：乙二胺四乙酸钠盐（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate） 1 GB/T38421—2019 TAMRA：6-羧基四甲基若丹明（6-carboxy-tetramethylrhodamine) Taq酶:DNA聚合酶（TaqDNApolymerase) Tris：三羟甲基氨基甲烷[（hydroxymethyl)methylaminomethane] 18SrRNA：真核生物核糖体小亚基18S基因（18SribosomalRNA） 4原理 提取动物毛皮试样中的DNA，针对水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊、绵羊物种特异性的内源基因 序列设计引物，通过特异性引物和标记荧光物质探针，对动物源性的DNA进行实时荧光PCR扩增，根 据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对毛皮中动物源性成分的定性分析。 5试剂和材料 5.1一般规定：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。 5.2灭菌水。 5.3氢氧化钠(NaOH)。 5.4三羟甲基氨基甲烷(Tris)。 5.5 盐酸(HCI) 5.6 乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）。 5.7 十二烷基硫酸钠（SDS)。 5.8 氯化钠。 乙酸钠。 5.10 冰乙酸。 5.11 蛋白酶K（20mg/mL），一20℃条件下保存。 5.12 二硫苏糖醇(DTT)。 5.13 苯酚（Tris平衡酚，pH7.0~8.0）。 5.14 三氯甲烷。 5.15 异丙醇。 5.16 无水乙醇。 5.17 乙醇溶液（体积分数75%）：取75mL无水乙醇（5.16），加水定容至100mL。 5.18 Tris-HCl缓冲液(1mol/L·pH=7.6和pH=8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(5.4),溶于800mL 5.19NazEDTA溶液（0.5mol/L，pH=8.0）：称取186.1gNazEDTA(5.6)，溶于700mL水中，用氢氧 5.20氢氧化钠溶液（5mol/L）：称取40g氢氧化钠（5.3)溶于100mL水中，冷却后，加水定容至200mL。 5.21 氯化钠溶液（5mol/L）：称取58.44g氯化钠（5.8）溶于100mL水中，加水定容至200mL。 5.22 SDS裂解缓冲液：在500mL水中分别加人100mLpH为7.6的Tris-HCI缓冲液（5.18）、 1L，121℃条件下高压灭菌20min 调节pH至5.2，加水定容至200mL。 NazEDTA溶液（5.19），加水定容至1L，121℃条件下高压灭菌20min。 5.25DNA吸附柱。 2 GB/T 38421—2019 5.26 DNA提取试剂盒。 5.27 实时荧光PCR试剂盒，包括Taq酶、dNTPs、PCR体系缓冲液等，按试剂盒要求保存 5.28 水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊基因组DNA，0℃～4℃条件下保存。 5.29 引物和探针：所需引物和探针信息见表1，一20℃条件下保存。 表1引物和探针信息 引物名称 引物和探针序列（5'-3'） 目标基因 正向 CCTGAGAAACGGCTACCAT 真核生物18SrRNA 内参引物探针 反向 CGTGTCAGGATTGGGTAAT 基因(内参基因) 探针 (FAM)TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT(TAMRA) 正向 CCACTAACATCATCCATCACCA 水貂内源基因 水貂引物探针 反向 AATGAGTGGGTAGGGCATGG （线粒体基因） 探针 (FAM)CTCCCATCCTAGCCCTAACACTAGCCCTT(TAMRA) 正向 TAATCGTCACCGCACATGCC 兔内源基因 兔引物探针 反向 CTATGTCAGG AGCCCCAATT ATCA (线粒体基因） 探针 (FAM)ACAAGCCAGT TCCCGAAGCC TCCA(Eclipse) 正向 CCTATCCCTCTCCCACGTATGAA 貉子内源基因 貉子引物探针 反向 TTAGGGATGAAACCGGATAGTGG (线粒体基因) 探针 (FAM)CATTGATAACCTCCGTCATCCTGGCCC(TAMRA) 正向 GCTGACTTCCAATCAACTAGTTCTG 浣熊内源基因 浣熊引物探针 反向 AGCTGTGGTAATCAGAACGCGAT （线粒体基因） 探针 (FAM)CCTACTTACCAACACACTCCTAGCCTCC(TAMRA) 正向 CTTCAACCCCACAGCGTCCATCA 马内源基因 马引物探针 反向 AGCGATCATCATTAACCTCATACAC （线粒体基因） 探针 (FAM)TACTCAGAAGTGGAATGGTGTGAG(TAMRA) 正向 CCGATGGATGTTCAGAGCT 牛内源基因 牛引物探针 反向 GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC (生长激素基因） 探针 (FAM)TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA(TAMRA) 正向 TGCACTAACCACCCTAACCCTAT 山羊内源基因 山羊引物探针 反向 AAAGGCACATGAAACGACCGT （线粒体基因） 探针 (FAM)CCGCACCCATCATAATAACCAACCTCAAT(TAMRA) ACACAACTTCTACCACAACCC 绵羊内源基因 绵羊引物探针d AAACAATGAGGGTAACGAGGG （线粒体基因） (FAM)ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA (TAMRA) 该引物和探针见GB/T25165—2010。 b该引物和探针见GB/T21102—2007。 该引物和探针见GB/T25165—2010。 该引物和探针见GB/T25165—2010。 3