ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 38133—2019 转基因首实时荧光PCR检测方法 Genetically modified alfalfa detection method by real-time PCR 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 38133—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 技术中心、辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心 本标准主要起草人：付伟、朱鹏宇、刘津、魏霜、杜智欣、王晨光、朱水芳、黄文胜、郑秋月、曹际娟。 GB/T38133—2019 转基因首实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了首转基因成分的实时荧光聚合酶链式反应（PCR)定性检测方法。 本标准适用于种子、饲料中的转基因首J101、J163以及KK179品系的实时荧光PCR方法检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 ACC基因acetylCoAcarboxylase 编码乙酰辅酶A羧化酶的基因。 注：在本标准中作为首荐的内标准基因。 3.2 18S核糖体RNA18SrRNA 编码真核生物18S核糖体RNA的基因。 注1：在本标准中作为首猎的内标准基因。 注2：实际检测中，3.1和3.2选择一种使用即可。 3.3 FMV35S启动子35SpromoterfromamodifiedFigwortmosaicvirus 编码玄参花叶病毒的35S启动子的基因。 注：在本标准中作为转基因首猎J101和J163的启动子。 3.4 E9终止子3'termination region frompea ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase 来源于源自豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基（RbcS)E9基因的3'非翻译区，存在于转基因首 猎J101与J163品系中。 3.5 CP4-EPSPS基因5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthasegene 源自AgrobacteriumCP4菌株，用于编码莽草酸途径中的关键酶的基因，存在于转基因首猎J1o1 与J163品系中。 1 GB/T38133—2019 3.6 CTP2 基因chloroplast transit peptide coding sequence 源自ArabidopsisthalianaEPSPS的叶绿体转运肽，用于引导CP4-EPSPS蛋白在芳香族氨基酸 合成的基因。 3.7 NOs终止子nosterminator 来自根癌农杆菌pTi的胭脂碱合酶（nos）基因的3'UTR序列区，用于编码NOS，指导聚腺苷酸化 的基因，存在于转基因首KK179品系中。 3.8 Pal2启动子Pal2promoter 来自菜豆的Pal2基因启动子，含有指导植物细胞转录的编码苯丙氨酸解氨酶的基因，存在于转基 因首著KK179品系中。 4试验原理 应用TaqMan探针技术，根据常用的筛选基因（启动子、终止子等）序列、品系特异性序列和首猎内 源基因序列，设计引物和荧光探针，对样品中基因组DNA进行PCR扩增。在PCR反应过程中，荧光信 5 试剂与材料 除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。 5.1DNA提取试剂盒。 5.2实时荧光PCR预混液 5.3内标准基因引物和探针（探针5端标记荧光基团，3端标记荧光淬灭基团）。 5.3.1ACC基因引物和探针： 上游引物ACC-F:5'-GATCAGTGAACTTCGCAAAGTAC-3 下游引物ACC-R：5'-CAACGACGTGAACACTACAAC-3 探针 ACC-P:5'-TGAATGCTCCTGTGATCTGCCCATGC-3° 5.3.218SrRNA基因引物和探针： 上游引物18S-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCA-3' 下游引I物18S-R:5-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 探针18S-P:5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3 5.4外源基因引物和探针（探针5'端标记荧光基团，3端标记荧光淬灭基团）。 5.4.1J101转化事件特异性序列引物和探针： E游引I物J101-F:5'-GTACTGATCTTGTGTCATAGTTTC-3 下游引物J101-R:5'-ACTGAGAATTAGCTTCCACTC-3 探针J101-P:5'-ACTGAAGGCGGGAAACGACAATCT-3' 5.4.2J163转化事件特异性序列引物和探针： 上游引物J163-F：5°-GCCGGGACAAGGTCATC-3 下游引物J163-R：5'-TGGACTGAGAATTAGCTTCCAC-3' 探针J163-P:5'-TGAAGTGTTCGGTGGGAAACGACA-3' 5.4.3KK179转化事件特异性序列引物和探针： 2 GB/T 38133—2019 上游弓I物KK179-F:5-AGGACCTGCAGAAGCTA-3 下游引物KK179-R：5'-CTAGGCTAAAGTAAGATATCGAAGA-3 探针 KK179-P:5-TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA-3 5.4.4FMV35S启动子基因引物和探针： 上游引物FMV35S-F：5'-TGACAGCCCACTCACTAA-3 下游引物FMV35S-R:5'-CAATCTGGAATGCTGCTAAATC-3 探针FMV35S-P:5'-TATGACGAACGCAGTGACGACCAC-3 5.4.5CTP2基因引物和探针： 下游引物CTP2-R：5'-CATCCCACTCTTCTTCAATCC-3 探针 CTP2-P:5'-ATCGGTTTCTCTGAAGACGCAGCA-3' 5.4.6CP4-EPSPS基因引物和探针： 上游引物EPSPS-F：5'-CAGCATCCACGAGCTTATC-3 下游引物EPSPS-R:5'-GGAAACAGAAGACATGACCTTA-3 探针EPSPS-P:5-ACGTCATCCCACTCTTCTTCAATCCC-3 5.4.7E9基因引物和探针： 上游引物E9-F：5'-GTACCATTTGTTGTGCTTGTAA-3 下游引物E9-R:5'-GGACCATATCATTCATTAACTCTTC-3 探针E9-P:5'-TCGCTATCGAACTGTGAAATGGAAATGGA-3 5.4.8Pal2基因引物和探针： 上游引I物Pa12-F:5-GCATCGTTACCACCCTTTAT-3° 下游引物Pal2-R:5'-GTAGTGCGTAATGTGGTGAA-3 探针Pal2-P:5'-ACCAGACACCAACGCTCCAGATTT-3 5.4.9NOS终止子基因引物和探针： 上游引物TNOS-F：5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3 下游引物TNOS-R:5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3 探针 TNOS-P:5'-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-3 6 仪器与设备 6.1分析天平：感量0.1mg。 6.2生物安全柜。 6.3 实时荧光PCR扩增仪。 6.4 重蒸馏水发生器或纯水仪 6.5 涡旋振荡仪， 6.6 其他相关仪器和设备。 6.7 不同量程移液器。 7 操作步骤 7.1抽样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行 3