ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 38132—2019 转基因植物品系定量检测数字PCR法 Quantitative determination of genetically modified plants by digital PCR method 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T38132—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口 究院、中国农业科学院生物技术研究所、中国测试技术研究院生物研究所、甘肃国研检验检测有限公司、 本标准主要起草人：梁文、付伟、李亮、刘刚、李妍、车团结、周李华、林华、杨镇州、朱鹏宇、马丽侠 樊春海、王丽华、张莹。 GB/T38132—2019 转基因植物品系定量检测数字PCR法 1范围 本标准规定了转基因植物品系的数字PCR定量检测方法 本标准适用于种子及物理加工种子样品中转基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162 品系，转基因大豆GTS-40-3-2品系，转基因水稻克稻品系，转基因棉花GHB119品系，转基因油菜 RT73品系的数字PCR法定量检测 本方法的定量检测限为0.1%（质量分数）。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用干本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T4853（所有部分）转基因大米定量检测数字PCR法 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 品系特异序列 event specific sequence 外源DNA片段插人受体作物基因组后重组产生的邻接区序列。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Adh-l：玉米乙醇脱氢酶基因（Alcoholdehydrogenase1） Adhc:乙醇脱氢酶C基因（Alcohol dehydrogenaseCgene) PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） PEP：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Phosphoenolpyruvatecarboxylasegene） PLD：磷脂酰胆碱磷脂水解酶基因（PhospholipaseDgene) 4原理 数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增 并后续检测。通过对反应体系进行有限的分割，从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子，并且 更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。 1 GB/T38132—2019 目前数字PCR包括芯片式数字PCR和微滴式数字PCR两种。芯片式数字PCR通过微流控芯片 实现对原始反应体系的分割，这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点，但试验成本相对较高；微滴 式数字PCR通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，这种分割方式反应速度快，分割成本更低。 物外源基因（品系特异序列）和植物内源基因的拷贝数含量。样品DNA中的外源基因和内源基因的拷 5试剂和材料 5 除另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1植物基因组DNA提取试剂盒：推荐针对不同的样品选取不同的基因组提取试剂盒 5.2数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5°-3°外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字 PCR专用预混试剂，推荐按照不同的数字PCR仪说明书选择。 5.3 3引物及探针：检测不同植物品系的引物探针序列具体信息见表1。扩增序列的信息参见附录A。 表1车 转基因植物外源基因及内源基因的引物和探针序列 靶标 类别 名称 序列 上游引物 GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA 玉米MON810品系 外源 下游引物 GGATGCACTCGTTGATGTTTG 特异序列 探针 FAM-AGATACCAAGCGGCCATGGACAACAA-BHQ1 上游引物 TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT 玉米MON89034 外源 下游引物 CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA 品系特异序列 探针 FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB 上游引物 CACCTTCAGCAACCCGAACTA 玉米MIR162品系 外源 下游引物 GCTTAGCCTCCACGATCATCTT 特异序列 探针 FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT-BHQI 上游引物 CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC 玉米基因Adh-1 内源 下游引物 CCACTCCGAGACCCTCAGTC 探针 VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1 上游引物 TAGCATCTACATATAGCTTC 大豆GTS-40-3-2 外源 下游引物 GACCAGGCCATTCGCCTCA 品系特异序列 探针 FAM-ACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGA-BHQ1 上游引物 GCCCTCTACTCCACCCCCA 大豆基因Lectin-1 内源 下游引物 GCCCATCTGCAAGCCTTTTT 探针 VIC-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1 上游引物 TCCGCAATGTGTATTAAGTTGTCTAA 水稻克稻品系 外源 下游引物 CCGATATGCCTGCCCATCT 特异序列 探针 FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCG-BHQI 2 GB/T 38132—2019 表1(续) 靶标 类别 名称 序列 上游引物 TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT 水稻基因 内源 下游引物 CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC PLD 探针 VIC-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1 上游引物 CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA 棉花GHB119品系 外源 下游引物 GAAATTGCGTGACTCAAATTCC 特异序列 探针 FAM-CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTAC-BHQ1 上游引物 CACATGACTTAGCCCATCTTTGC 棉花基因 内源 下游引物 CCCACCCTTTTTTGGTTTAGC Adhc 探针 FAM-TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAATG-BHQ1 上游引物 CCATATTGACCATCATACTCATTGCT 油菜RT73品系 外源 下游引物 GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA 特异序列 探针 FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-BHQ 上游引物 CCCTTGTGAAGCTCGACATC 油菜基因 内源 下游引物 CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT PEP 探针 FAM-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-BHQ1 6 仪器与设备 数字 PCR仪。 6.1 6.2 分析天平：感量0.1mg。 生物安全柜。 6.3 6.4 核酸定量仪。 6.5 涡旋振荡仪。 6.6 移液枪：量程0.1μL～2.5μL；量程0.5μL～10μL；量程10μ～100μL；量程100μL～1000μL。 操作步骤 7 7.1 抽样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行 7.2 制样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行 7.3 DNA模板制备 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行。 3