ICS 07.080 A40 中华人民共和国国家标准 GB/T 38164—2019 常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法 Identification of animal ingredient from common livestock and poultry- Real-time PCR 2019-10-18实施 2019-10-18发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 38164—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、大连海关、青岛海关、上海海关、沈阳海关 本标准主要起草人：陈颖、韩建勋、郑秋月、高宏伟、张舒亚、王娉、孙敏、邢冉冉、张九凯、邓婷婷 王金玲、徐君怡。 SC 1 GB/T38164—2019 常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了常见畜禽动物源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于肉及加工品、内脏、乳、动物饲料中黄牛、耗牛、水牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、马鹿、梅花 鹿、驯鹿、兔、狗、鸡、鸭、鹅、鹤鹑、鸽子、火鸡、猫、狐狸、水貂、貉、鼠物种成分的Taqman探针实时荧光 PCR 定性检测。 检出限（LOD)1%（质量分数）。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法 GB/T35918动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法 3术语和定义、缩略语 3 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光PCR real-timePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程 3.1.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP8：ATP合成酶亚基8（ATPsynthasesubunit8) COI：细胞色素C氧化酶亚基I（CytochromeCoxidaseI） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrithylammoniumbromide) cytb：细胞色素b(Cytochromeb) DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid) D-loop:D-环区(Displacement loop region) EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) 1 GB/T38164—2019 Na2-EDTA：乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt) NDl：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶亚基1(Nicotinamideadeninedinucleotideoxidoreductase subunit 1) TaqDNA聚合酶：耐热DNA聚合酶（TaqDNApolymerase) Tris：三羟甲基氨基甲烷(Trishydroxymethylaminomethane) 4 原理 通过物种特异性引物及探针进行畜禽动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中 每一个循环产物荧光信号进行判定，实现对常见畜禽动物源性成分的定性检测。 5 检测用引物和探针 内参照引物探针序列和常见畜禽动物特异性引物探针序列见表1。 表1引物探针序列 目标物种 序列 基因来源 F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参基因 R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 18S rRNA基因 P:5'FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-3'TAMRA F:TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT 黄牛 R:TGACTGTTGCTCCTCAGAATGATA cytb基因 P:5'FAM-AGCATTTATAGGATACGTCC-3'MGBNFG F:GACTAATATTCGAAAATCC 耗牛 R:CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC cytb 基因 P:5'FAM-CAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT-3'TAMRA F:TTCATTGAYCTCCCTGCTCC 水牛 R:GGAATAGGCCGGTGAGGATT ATP8基因 P:5'FAM-ACTTTGGCTCTCTCC-3'MGBNFG F:ATTCTTTGCCTTCCACTTCA 骆驼 R:AGCGTATGCGAATAGGAAAT cyth基因 P:5'FAM-CCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGAC-3'TAMRA F:CCTACCACCGAAGCAATAGTGG 梅花鹿 R:GGTGCACTCTCAATAACTTCTGAGA COI基因 P:5'FAM-CACTGTAGCTACTCAAGAAGC-3'TAMRA F:TAGTTATGTAAACAAGACTG 马鹿 R:ATAGACTGTAGTAGCAAGGAA 12SrRNA基因 P:5'FAM-AGGACTTGGCGGTGCTTTAT-3'TAMRA F:CTCCCAGTACGAAAGGACCA 驯鹿 R:GGGCGGGATATGTTTGTGTA 16SrRNA基因 P:5'FAM-CCAACTTTAATCAAGCGCCT-3'TAMRA 2 GB/T 38164—2019 表1 (续) 目标物种 序 列 基因来源 F:TGGAGTAATCCTCCTGCTC 山羊 R:GGATTGCTGAAAGAAGATTA cytb 基因 P:5'FAM-CATAGGCTATGTTTTACCATGAG-3'TAMRA F:CGGAGTAATCCTCCTATTTGC 绵羊 R:CTAGGCTTGTGCCAATATATGGA cytb 基因 P:5'FAM-TATTACCAACCTCCTTT-3'MGBNFG F:GAGCAACCCCTCAACGTACT 鸽子 R:ACCTCCTCGTCGATATGGACTC 16SrRNA基因 P:5'FAM-CCCCTCAACGTACTAACAGTAACCAGAC-3'TAMRA F:GGCCACACAAATCCTCACAG 鸭 R:TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA cytb基因 P:5'FAM-CCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGAC-3'Eclipse F:CCACCGCGAATCCTCAAT 鹅 R:TCTTGTTTTTGGAGGATTTGTTCTC 16SrRNA基因 P:5'FAM-CCATCGCAGAGCCTGGTCGATATTTTT-3'Eclipse F:GGATCACTTTGCCCACTTTAA 鹑 R:GGGTGACGGGCGGTATG 12SrRNA基因 P:5'FAM-ATGGCCCTGAGGCAC-3'Eclipse F:GCTTCAATCCTCTATTTCATAA 水貂 R:GCTTCTTCCTTGAGTCTTA cytb 基因 P:5'FAM-CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT-3'Eclipse F:CTGCTGTCTTACTACTTCTA 猫 R:GGTGTTTAGGTTTCGATC COI基因 P:5'FAM-CACTTCCAGTCTTAGCAGCGG-3'Eclipse F:TAATCGTCACCGCACATGCC 兔 R:CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA COI基因 P:5'FAM-ACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA-3'Eclipse F:ATCTACATGATTCATTACAATTAC 猪 R:CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA ATP8 基因 P:5'FAM-ATCTCAAACTACTCATACCCA-3'TAMRA F:TCCAGGTAAACCCTTCTTCCC 狗 R:TTACGAGCAAGGGTTGATGGT D-loop 基因 P:5'FAM-ATCACTTAGTCCAATAAGG-3'MGBNFG F:TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT 狐狸 R:GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG COI基因 P:5'FAM-CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'TAMRA F:AATCTTGCCTGGGTTTGGAA 貉 R:CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA COI基因 P:5'FAM-CATACTACTCCGGGAAAA-3'MGBNFG 3