ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 38086—2019 生物样品中金属硫蛋白含量的测定 Determination of metallothionein (MT) in biological samples 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T38086—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、深圳市计量质量检测研究院、上海市 计量测试技术研究院、成都大学四川抗菌素工业研究所、吉林省检验检疫局技术中心、哈尔滨商业大学 食品学院、哈尔滨春源生物科技开发有限公司。 本标准主要起草人：王志强、王韦达、董珊、周婕、杜业刚、李兰英、杨晨、容会、张根生、张福源、吴楠、 彭丽萍、王世琨、姜雯、刘文超、孔鲁裔、牟钰、徐凤霞、王海宽、李碧芳、杨俊、李意、刘奕雄、杨国武。 GB/T38086-—2019 生物样品中金属硫蛋白含量的测定 1范围 本标准规定了生物样品中兔源金属硫蛋白I型和IⅡI型（MT-I和MT-ⅡI）测定的液相色谱-串联质 谱法。 本标准适用于生物制剂或生物提取物等生物样品中免源金属硫蛋白I型和Ⅱ型总含量的测定。 本方法的检出限为6.2mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义、缩略语 3 SAG 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 特征肽段specificpolypeptide 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶水解产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。 3.1.2 金属硫蛋白 metallothionein 一类富含半胱氨酸且具有高度结合金属能力的低相对分子质量蛋白质。 3.1.3 金属硫蛋自I型和Ⅱ型 metallothioneinIandl 在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其功能调节的一类蛋 白质。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DTT:二硫苏糖醇(Dithiothreitol) IAA：碘代乙酰胺（2-lodoacetamide） MT：金属硫蛋白（Metallothionein） 4原理 试样经胰蛋白酶酶切后产生特征肽段，用液相色谱-串联质谱法测定试样中特征肽段的含量，按照 免源MT-I和MT-Ⅱ平均相对分子质量与特征肽段的相对分子质量比值为6.16,计算出试样中MT-I 1 GB/T38086—2019 和MT-IⅡI的总含量。 5试剂 试验用水为GB/T6682中规定的一级水。 5.1碳酸氢铵（NH,HCO）：分析纯。 5.2 二硫苏糖醇（CHioOSz）：生化级。 5.3碘代乙酰胺（ICH,CONH）：生化级 一18℃冷冻保存。 5.5 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 5.6 乙腈(CH.CN)：色谱纯 5.7 碳酸氢铵溶液（100mmol/L）：称取0.395g碳酸氢铵，用水溶解后定容至50mL。 5.8 3二硫苏糖醇溶液（1mol/L）：称取1.542g二硫苏糖醇，用碳酸氢铵溶液溶解后定容至10mL。 5.9碘代乙酰胺溶液（1mol/L）：称取1.850g碘代乙酰胺，用碳酸氢铵溶液溶解后定容至10mL。 5.10胰蛋白酶溶液（200μg/mL）：移取20μg胰蛋白酶用100μL碳酸氢铵溶液溶解。 5.11 甲酸溶液（0.1%，体积分数）：移取1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。 6 仪器设备及器具 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 6.2 蛋白超滤管：5000Da~10000Da(1Da~1.66×10-27kg）。 6.3 蛋白低吸附离心管：1.5mL。 6.4天平：感量0.01g0.00001g 涡旋混合器。 6.5 6.6 6.77 高速冷冻离心机：最高转速不低于14000r/min。 6.8 恒温水浴锅：37℃。 7分析步骤 7.1特征肽段合成 序列CAQGCICK为合成肽段，经脱盐纯化工艺，其中的半胱氨酸是由碘代乙酰胺试剂进行了烷基 化修饰，标记为[CAM]。合成的特征肽段物质信息见附录A。特征肽段一18℃冷冻保存。 7.2 2特征肽段溶液配制 特征肽段储备溶液：准确称取肽段0.0020g溶于1.0mL碳酸氢铵溶液中，制备成2.0μg/μL储备 液，一18℃冷冻保存，有效期1个月。 标准工作溶液：用碳酸氢铵溶液稀释上述特征肽段储备溶液，配制成160L中含特征肽段质量为 0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg和2.0μg的工作溶液，现用现配 2 GB/T38086—2019 7.3测定 7.3.1试样制备 称取0.002g（精确至0.0001g）试样，置于1.5mL低吸附离心管中，用1mL碳酸氢铵溶液溶解， 7.3.2试样酶解 取上述试样40μL置于1.5mL低吸附离心管中，依次加60uL碳酸氢铵溶液，4μLDTT溶液，混 匀后37℃恒温水浴1h；冷却至室温，加人20μLIAA溶液，避光静置30min，对半胱氨酸进行烷基化 100μL碳酸氢铵溶液洗膜，14000r/min4℃离心30min，再重复两次；加人100μL碳酸氢铵溶液于超 4℃离心洗脱，再加人50μL碳酸氢铵溶液洗脱，收集两次含特征肽段的洗脱液混匀待测。 7.3.3仪器参考条件 7.3.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下所示： 色谱柱：Cis柱（2.1mmX50mm，1.7μm）或柱效相当者； b) 流动相：梯度洗脱条件见表1； 流动相流速：0.3mL/min; (P 色谱柱柱温：30℃； e) 样品室温度：4℃； f) 进样体积：4uL。 表1流动相梯度洗脱参考条件 时间 0.1%甲酸溶液（体积分数） 乙睛（体积分数） min % % 0 95 5 0.5 95 5 3.5 70 30 4.0 10 06 4.7 10 90 5.4 95 5 6.0 95 5 7.3.3.2 2质谱参考条件 质谱参考条件如下： 离子化模式：电喷雾电离正离子扫描模式； a) b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM)； 喷雾电压（IS）：5500V； ) d) 雾化气压力（GS1）：0.379MPa； e) 辅助气压力（GS2）：0.379MPa； 3